發(fā)布時間：2018-12-18 07:14

【摘要】：前言： 視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一種遺傳性進行性視網(wǎng)膜退行性病變，在視網(wǎng)膜變性類疾病中，具有典型的代表性。RP國際發(fā)病率為1/3500～1/4000，好發(fā)于青壯年。目前認為該病的發(fā)生是由于視網(wǎng)膜色素上皮（retinalpigment epithelium，RPE）對光感受器細胞脫落的外節(jié)膜盤吞噬功能下降，致使其在視網(wǎng)膜外層堆積，光感受器細胞外節(jié)段結構紊亂，最終至光感受器細胞變性死亡�，F(xiàn)階段治療RP已嘗試多種方式，包括細胞移植治療、基因治療、細胞因子治療、營養(yǎng)因子治療]和高壓氧治療等。 近年來，細胞移植療法和基因療法在治療視網(wǎng)膜色素變性中取得了較大進展�；虔煼ㄍㄟ^高表達神經(jīng)營養(yǎng)因子基因或抗凋亡基因，發(fā)揮神經(jīng)保護或抗凋亡作用。在細胞移植療法中，移植細胞替代已經(jīng)凋亡的細胞，也可通過分泌生長因子保護視網(wǎng)膜細胞。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）在細胞移植療法中具有廣闊的應用前景，同時還是一種良好的載體，可介導外源基因穩(wěn)定表達。因此將基因治療及細胞治療結合在一起，對BMSCs進行基因修飾后再移植到患者體內(nèi)，既可以表達外源目的基因，也可同時發(fā)揮自身的營養(yǎng)保護及分化作用，理論上對治療變性視網(wǎng)膜疾病具有重要探索意義。 視網(wǎng)膜的神經(jīng)上皮層是由6種神經(jīng)元細胞組成。分別為：視桿細胞和視錐細胞，專司感光；雙極細胞，約有10到數(shù)百個光感受器細胞通過雙極細胞與一個神經(jīng)節(jié)細胞相聯(lián)系，起到聯(lián)絡作用；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cell，RGC），負責傳導視覺信號；水平細胞和無長突細胞，負責視覺信息橫向聯(lián)系。故RP中視網(wǎng)膜細胞變性死亡，其本質為神經(jīng)元結構及功能發(fā)生變化，最終變性凋亡。 GAP-43（growth-associated protein-43）是一種神經(jīng)生長的相關蛋白，與神經(jīng)發(fā)育和再生密切相關。我們之前利用抑制性消減雜交技術(suppression subtractivehybridization，SSH)篩選出差異表達基因GAP-43，發(fā)現(xiàn)GAP-43基因在BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中起著重要作用。GAP-43基因導入原代BMSCs內(nèi)后，體內(nèi)外實驗均證實了該基因對于BMSCs向視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞方向分化具有明顯的促進作用。 皇家外科學院大鼠（Royal College of Surgeons rat，RCS rat）是遺傳性RP典型動物模型，本實驗將經(jīng)GAP-43基因修飾的BMSCs移植入RCS大鼠眼中，探討在不同微環(huán)境下，GAP-43基因修飾的BMSCs分化情況；同時在細胞形態(tài)和功能角度上觀察移植后對視網(wǎng)膜各層細胞產(chǎn)生的影響，特別是對視網(wǎng)膜光感受器細胞的保護作用，探討視網(wǎng)膜色素變性新的治療途徑。 目的： 探討GAP-43基因修飾的BMSCs對RCS大鼠視網(wǎng)膜保護作用。 方法： 利用單純貼壁法在體外分離、培養(yǎng)SD大鼠BMSCs，經(jīng)流式細胞術鑒定，得到狀態(tài)穩(wěn)定的BMSCs。構建慢病毒介導的GAP-43高表達載體（LV5-GAP），感染BMSCs后，得到GAP-43基因修飾的BMSCs（BMSCs-LV5-GAP-43）。將67只出生21天（P21）的雄性RCS大鼠隨機分為三組：BMSCs+GAP-43組、BMSCs組和NC組。BMSCs+GAP-43組是將5×104/2ul GAP-43基因修飾的BMSCs的細胞懸液注射到RCS大鼠視網(wǎng)膜下；BMSCs組注射5×104/2ul BMSCs細胞懸液；NC組大鼠則僅將2ul PBS注射入視網(wǎng)膜下。應用免疫熒光，Western Blot免疫印跡法檢測GAP-43、谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthetase，GS)和視紫紅質（rhodopsin，Rho）表達水平。利用HE染色評估視網(wǎng)膜外核層（outer nuclear layer，ONL）厚度。應用原位末端轉移酶標記技術（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotinnick end labeling assay，TUNEL assay）評估視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡情況。應用WesternBlot免疫印跡法檢測外源性凋亡通路介導因子Caspase-8和內(nèi)源性凋亡通路介導因子Caspase-9的表達量，闡明GAP-43在視網(wǎng)膜色素變性中抗凋亡的途徑及機制。 結果： （1）體外分離培養(yǎng)的BMSCs可穩(wěn)定傳代，流式細胞儀檢測細胞抗原：CD90和CD44表達陽性，CD11b和CD45表達陰性；GAP-43基因序列經(jīng)酶切、轉化、包裝和轉染得到慢病毒載體LV5-GAP；感染BMSCs后，Western Blot及細胞免疫熒光檢測GAP-43在BMSCs-LV5-GAP-43中表達量升高（P＜0.05）；將細胞移植到視網(wǎng)膜下腔后，Western Blot顯示， BMSCs+GAP-43組RCS大鼠視網(wǎng)膜下細胞移植后GAP-43表達顯著增加（P＜0.05）； （2）Western Blot及免疫熒光檢測顯示，Rho在BMSCs+GAP-43組表達顯著上調(diào)（P＜0.05），但BMSCs組與BMSCs+GAP-43組相比，GS在BMSCs組顯著上調(diào)（P＜0.05）；組織學分析顯示， BMSCs+GAP-43組ONL高度明顯大于其他兩組（P 0.05）； （3）細胞注射到視網(wǎng)膜下30天后，TUNEL檢測顯示， BMSCs+GAP-43組TUNEL陽性細胞數(shù)量與其他組相比明顯減少（P0.05）； （4）Western Blot免疫印跡法顯示，Caspase-8和Caspase-9在BMSCs+GAP-43組被顯著下調(diào)（P0.05）。 結論： （1）本研究成功分離、培養(yǎng)出大鼠BMSCs，，并構建了穩(wěn)定攜帶GAP-43基因的慢病毒載體；感染BMSCs后能穩(wěn)定、持久的表達GAP-43蛋白，移植BMSCs-LV5-GAP-43到RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔，發(fā)現(xiàn)BMSCs在變性視網(wǎng)膜環(huán)境中逐漸消失，但是GAP-43表達量逐漸升高。 （2）BMSCs-LV5-GAP-43移植到視網(wǎng)膜下腔，能減輕Müller細胞增殖作用，防止產(chǎn)生“膠質封閉”；BMSCs-LV5-GAP-43能保護光感受器細胞，維持視網(wǎng)膜光感受器細胞結構的完整性。 （3）采用TUNEL方法檢測到凋亡細胞主要集中在ONL，BMSCs-LV5-GAP-43移植后通過抗凋亡作用保護光感受器細胞，并且阻斷由Caspase-9和Caspase-8介導的細胞內(nèi)外源凋亡途徑，抑制神經(jīng)元凋亡，維持視網(wǎng)膜外核層完整性。 （4）GAP-43基因修飾的BMSCs在RCS視網(wǎng)膜變性的2個月內(nèi)，對RP視網(wǎng)膜有保護及抗凋亡作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R774.1

【參考文獻】

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1 霍冬梅;董方田;于偉泓;高斐;;骨髓間充質干細胞在視網(wǎng)膜色素變性大鼠視網(wǎng)膜下的分化(英文)[J];國際眼科雜志;2010年10期

2 劉斌,唐軍民,朱秀安,唐巖;RCS大鼠視網(wǎng)膜感光細胞的凋亡[J];解剖學報;1998年04期

3 李躍萍;宋麗萍;邱曙東;;慢病毒載體在腫瘤基因治療中的應用[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學;2006年12期

本文編號：2385540