發(fā)布時間：2018-12-15 00:52

【摘要】：中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生問題一直是醫(yī)學(xué)研究的難點和熱點問題，視神經(jīng)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，由于其特殊的生理特性而成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的代表。故探討視神經(jīng)損傷后的修復(fù)問題，不僅對視功能的恢復(fù)也對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后功能的恢復(fù)有著重要意義。目前視神經(jīng)損傷后大量研究集中在如何促進神經(jīng)細胞再生，抑制或去除抑制神經(jīng)細胞再生的不利因素，盡管取得了較大成就，但是對于損傷后神經(jīng)的再生仍存在較多問題。大量研究表明，炎癥反應(yīng)在創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)損傷后的繼發(fā)性腦損害過程中發(fā)揮重要作用。 目前已發(fā)現(xiàn)多種細胞因子，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、化學(xué)因子、粘附分子等參與炎癥過程，并加重神經(jīng)損害。但迄今有關(guān)機理研究仍無突破性進展，尚不能給以有效地臨床指導(dǎo)。且上述炎癥分子均是其下游事件，據(jù)推測TLR4可能作為炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中的急性炎癥反應(yīng)損傷的扳機點啟動這種病理過程。近年來，隨著對革蘭氏陰性細菌的外膜成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)引起器官組織嚴(yán)重炎癥反應(yīng)機理研究的深入，機體固有性免疫細胞(如小膠質(zhì)細胞)表達的Ｔoll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)，在炎癥反應(yīng)中的作用和機理，引人關(guān)注。已有研究發(fā)現(xiàn)，LPS與TLR4特異結(jié)合，可激活TLR4，引起細胞活化，通過復(fù)雜的調(diào)控機理，引起下游多種細胞因子的產(chǎn)生和釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有性免疫功能，主要由小膠質(zhì)細胞完成，而炎癥因子的釋放主要是通過TLR4－NF-κB信號傳導(dǎo)途徑。隨著深入研究，發(fā)現(xiàn)TLRs也出現(xiàn)在沒有外源性病原體入侵的情況，TLR4配體除了LPS之外，熱休克蛋白(HSP60、70)，壞死細胞碎片等也是其配體。而神經(jīng)外傷后，在軸突損傷周圍也發(fā)現(xiàn)HSP60、70的出現(xiàn)。這一結(jié)果提示：和感染一樣，外傷也可能通過某種機制，上調(diào)CNS小膠質(zhì)細胞TLR4的表達，在創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷后參與調(diào)控炎癥反應(yīng)。 早于1988年Hashimot等在果蠅中發(fā)現(xiàn)了一類屬于I型跨膜蛋白的受體，命名為TLRs。TLRs是與果蠅Toll蛋白具有同源性的受體蛋白家族，不僅參與果蠅的胚胎發(fā)育過程，還在成年果蠅的免疫防御中發(fā)揮重要作用。1997年和1998年，Medazhitov和Rock等克隆出了另外一種Toll的同源物，即如今的TLR4蛋白。 最初，TLRs介導(dǎo)的細胞應(yīng)答一直被認為是促炎的宿主防御應(yīng)答,主要是消滅入侵的病原體，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)。然而研究發(fā)現(xiàn)TLRs也出現(xiàn)在沒有外源性病原體入侵的情況，例如阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，多發(fā)性硬化癥等神經(jīng)變性疾病。TLRs在CNS中主要在小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞表達，當(dāng)小膠質(zhì)細胞激活后，TLRs即迅速出現(xiàn)。而研究發(fā)現(xiàn)在視神經(jīng)損傷后，小膠質(zhì)細胞即被迅速激活。因此，當(dāng)視神經(jīng)損傷后，視網(wǎng)膜、視神經(jīng)小膠質(zhì)細胞TLR4的表達變化、意義，以及其引起炎癥鏈?zhǔn)狡俨挤磻?yīng)的機理研究，對這一系列問題的探討，對于進一步認識創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜及視神經(jīng)繼發(fā)性損害的發(fā)生機理，制定有效的診斷和治療措施，有重要意義。 現(xiàn)在認為，TLR4信號通道主要包括MyD88依賴和非依賴信號通道(TRIF通道)。而在神經(jīng)損傷后，活化的TLR4具體通過哪一條信號通道傳遞，不得而知。有可能通過TLR4激活的兩條信號通道在各自介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著獨特的作用。 以往的研究認為，核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是調(diào)控炎癥反應(yīng)強弱的核心，，它受各種物理及生化因子激活，誘導(dǎo)多種炎癥因子和酶等基因的表達，介導(dǎo)瀑鏈?zhǔn)窖装Y反應(yīng)的形成、發(fā)展及惡化。TLR4是LPS受體，早期識別侵入體內(nèi)的G-細菌并通過LPS－TLR4－NF-κB信號傳導(dǎo)途徑啟動炎癥反應(yīng)，目前傾向認為，TLR4－NF-κB信號傳導(dǎo)途徑，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一些病理狀態(tài)的發(fā)病基礎(chǔ)。那么，對于創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷后，發(fā)生的炎癥反應(yīng)是否也主要通過TLR4-MyD88-NF-κB信號傳導(dǎo)途徑啟動，并產(chǎn)生炎癥因子IL-6，TNF等，介導(dǎo)對視網(wǎng)膜、視神經(jīng)的炎性損傷，尚未見報道。 因此，本研究旨在圍繞小膠質(zhì)細胞TLR4表達變化、意義及信號通道對炎癥的調(diào)控這一中心問題深入展開，并明確TLR4在視神經(jīng)損傷后再生修復(fù)中的作用。 方法：本研究利用BALB/c小鼠建立視神經(jīng)損傷模型，通過免疫組化及western blot實驗證實TLR4在視神經(jīng)損傷后表達；通過對小鼠視神經(jīng)損傷后不同時間點的觀察，利用western blot及熒光定量PCR明確TLR4及其信號通路的部分關(guān)鍵分子在蛋白水平及mRNA水平的表達及變化趨勢；通過對TLR4基因突變及野生型小鼠視神經(jīng)鉗夾損傷的對比研究，利用熒光金標(biāo)記RGC觀察其凋亡情況，以及觀察神經(jīng)再生修復(fù)的關(guān)鍵蛋白GAP-43在視神經(jīng)上的表達變化，明確TLR4在視神經(jīng)損傷后再生修復(fù)中的作用及機制。通過以上研究，以此希望為輔助治療視神經(jīng)損傷后的再生修復(fù)奠定實驗基礎(chǔ)。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1、小鼠視神經(jīng)鉗夾傷后視神經(jīng)表達TLR4，隨著損傷時間延長，在視神經(jīng)、視網(wǎng)膜上的表達逐漸增加，并在2周左右達到高點，到第3、4周，TLR4的表達仍處于較高水平。提示TLR4激活在視神經(jīng)損傷后介導(dǎo)的無菌性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著一定作用。 2、小鼠視神經(jīng)損傷后，小膠質(zhì)細胞立即被激活，其活化標(biāo)志物Mac1表達在視神經(jīng)和視網(wǎng)膜上急劇增加，其后緩慢降低，并在第3、4周仍維持在較高水平。提示小膠質(zhì)細胞的活化介導(dǎo)了視神經(jīng)損傷后的無菌性炎癥反應(yīng)，且小膠質(zhì)細胞的活化與TLR4的激活相輔相成。 3、小鼠視神經(jīng)損傷后MyD88分子在視神經(jīng)上的表達逐漸升高，其蛋白和mRNA在傷后2、3周處于高水平；而TRIF分子在視神經(jīng)上的蛋白和mRNA表達水平變化不明顯。小鼠視神經(jīng)損傷后，效應(yīng)分子NF-κB和炎性因子IL-6、TNF-α在視神經(jīng)上的表達逐漸增加，并在傷后2、3周處于高水平。結(jié)果提示小鼠視神經(jīng)損傷后TLR4信號主要通過TLR4-MyD88-NF-κB通道傳遞,是視神經(jīng)損傷后產(chǎn)生無菌性炎癥反應(yīng)的一條重要通道，并介導(dǎo)了炎性因子的產(chǎn)生。 4、小鼠視神經(jīng)損傷后，通過TLR4基因突變型和野生型小鼠對比研究，在視神經(jīng)損傷早期，GAP-43蛋白在TLR4基因突變型小鼠視神經(jīng)上的表達相對較多，且視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡相對較少。提示TLR4介導(dǎo)的信號通道在視神經(jīng)損傷早期對視神經(jīng)具有一定損傷作用。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R774.6

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 賀曉生;重視對創(chuàng)傷性腦損傷炎癥反應(yīng)的研究[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2004年09期

本文編號：2379633