【摘要】：喉癌(laryngeal carcinoma)是常見的頭頸部惡性腫瘤,其主要的病理類型為鱗狀細(xì)胞癌。近年來,喉癌的發(fā)病率明顯增加,吸煙、飲酒、環(huán)境因素、放射線、病毒感染以及微量元素的缺乏,常常通過多種途徑、多個(gè)階段以及多種分子因素的綜合作用,而導(dǎo)致喉癌的發(fā)生。目前,喉癌主要的治療方案仍以手術(shù)治療和放射治療為主,其他還有化療、免疫治療、基因治療、中醫(yī)治療等綜合措施。喉癌的有效治療應(yīng)是：最大程度的根除腫瘤,保全喉的功能,保證患者的生存率,同時(shí)提高生存質(zhì)量。近年來隨著各地診療水平的提高,電子喉鏡檢查以及早期局部活檢,可使喉癌患者的生存率得到較大的提高。即便如此,仍有許多患者預(yù)后不佳,手術(shù)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)有發(fā)生。因此,探尋安全、有效、毒副作用小的治療道路,依舊任重而道遠(yuǎn)。惡性腫瘤細(xì)胞最大的特點(diǎn)是正常生長(zhǎng)調(diào)控系統(tǒng)對(duì)其失去控制,能不斷地分裂與增殖,具有“不死性”。因此,對(duì)腫瘤治療的重點(diǎn)是抑制其增殖,促進(jìn)其死亡。腫瘤的發(fā)生常涉及多個(gè)抑癌基因的突變、磷酸化或失活。將正常腫瘤抑制基因?qū)肽[瘤細(xì)胞以替代失去功能的基因,從而可以達(dá)到逆轉(zhuǎn)其惡性表型、抑制腫瘤生長(zhǎng),甚至消滅腫瘤的目的,是腫瘤基因治療的熱點(diǎn)。p16基因是人體內(nèi)重要的腫瘤抑制基因,該基因的突變和缺失與包括頭頸癌在內(nèi)的多種腫瘤密切相關(guān),恢復(fù)野生型p16蛋白的功能成為抗腫瘤基因治療研究的重要途徑。P16蛋白是一種周期依賴性蛋白激酶抑制劑,直接或間接調(diào)控細(xì)胞周期,使細(xì)胞周期停滯于G1期,而且它還具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。因此本課題將研究p16蛋白對(duì)人喉癌細(xì)胞系Hep-2生長(zhǎng)的影響,并從細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期兩個(gè)方面進(jìn)行機(jī)制探討。自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell, NK)是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分,無需預(yù)先致敏即可識(shí)別和殺傷靶細(xì)胞,是機(jī)體抗腫瘤免疫防御的第一道防線。由于NK細(xì)胞的殺傷活性受到細(xì)胞表面受體和細(xì)胞因子等多種分子的調(diào)控,在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮抗腫瘤作用。而同時(shí),腫瘤細(xì)胞可通過表達(dá)免疫抑制因子或表面配體等途經(jīng)反過來調(diào)節(jié)或抑制NK細(xì)胞的功能,負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答,從而造成免疫逃逸的環(huán)境。近年來,已有證據(jù)表明導(dǎo)入p16基因的腫瘤細(xì)胞其細(xì)胞表面分子的表達(dá)和細(xì)胞因子的分泌都會(huì)發(fā)生一定的改變,這可能有助于改變腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸狀態(tài)。因此,本研究還將初步探討Hep-2細(xì)胞的p16蛋白導(dǎo)入與機(jī)體NK細(xì)胞抗腫瘤作用之間的關(guān)系,為p16作為腫瘤治療靶點(diǎn)的應(yīng)用提供更為詳實(shí)的理論依據(jù)。研究目的1.擴(kuò)增攜帶野生型p16基因的重組腺病毒載體,并導(dǎo)入人喉癌細(xì)胞Hep-2中,觀察p16蛋白的表達(dá)情況。2.觀察表達(dá)野生型p16蛋白的人喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖情況,并從細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期兩方面探討其作用機(jī)制。3.初步探討表達(dá)野生型p16的人喉癌Hep-2細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷敏感性的變化,同時(shí)觀察該細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的調(diào)控作用。研究方法第一部分重組腺病毒載體的擴(kuò)增及其感染喉癌細(xì)胞Hep-2后p16蛋白的表達(dá)情況利用人胚腎細(xì)胞系HEK-293擴(kuò)增攜帶野生型p16基因的重組腺病毒載體；采用293細(xì)胞空斑試驗(yàn)測(cè)定重組腺病毒的滴度；重組腺病毒感染Hep-2細(xì)胞后,采用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot法檢測(cè)p16蛋白的表達(dá)情況。第二部分野生型p16蛋白對(duì)人喉癌細(xì)胞Hep-2體外生長(zhǎng)和體內(nèi)生長(zhǎng)的影響采用CCK8法檢測(cè)p16蛋白對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞儀檢測(cè)p16蛋白對(duì)Hep-2細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的影響；采用電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)；采用Q-PCR法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞凋亡蛋白和細(xì)胞周期蛋白的基因表達(dá)情況；Hep-2細(xì)胞接種于裸鼠背部皮下,采用重組腺病毒瘤內(nèi)注射的方式觀察p16蛋白體內(nèi)抑瘤作用；采用Tunnel法檢測(cè)瘤體組織的細(xì)胞凋亡情況。第三部分野生型p16蛋白對(duì)人喉癌細(xì)胞Hep-2與NK細(xì)胞之間相互作用的影響采用CCK8法檢測(cè)p16導(dǎo)入后喉癌Hep-2細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷敏感性的情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)p16導(dǎo)入后Hep-2細(xì)胞表面NK活化受體配體的表達(dá)情況；qRT-PCR檢測(cè)p16導(dǎo)入后Hep-2細(xì)胞IL-6、IFN-γ、IL-10和TGF-β的基因表達(dá)情況；ELISA檢測(cè)p16導(dǎo)入后Hep-2培養(yǎng)上清中TGF-β的分泌情況；p16蛋白導(dǎo)入后Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育NKL細(xì)胞,CCK8法檢測(cè)該NKL對(duì)Hep-2細(xì)胞的殺傷情況；采用添加或阻斷的TGF-β方式,確認(rèn)Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清的TGF-β是否參與了對(duì)NK細(xì)胞殺傷功能的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果第一部分重組腺病毒載體的擴(kuò)增及其感染人喉癌細(xì)胞Hep-2后p16蛋白的表達(dá)情況1.利用HEK-293細(xì)胞擴(kuò)增重組腺病毒載體后,采用293細(xì)胞空斑試驗(yàn)測(cè)定重組腺病毒的滴度,Ad-p16的滴度為6.5×1010, Ad-LacZ的滴度為4.8×1010。2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)p16蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示,Ad-p16組Hep-2細(xì)胞感染重組腺病毒3h、6h、12h和24h時(shí)p16蛋白的表達(dá)率分別為29.5%、85.0%、92.7%和95.4%。未感染Ad-p16組的Hep-2細(xì)胞中無p16蛋白表達(dá)。3. Western blot檢測(cè)結(jié)果也顯示Ad-p16感染的Hep-2有明顯p16蛋白的表達(dá)。第二部分野生型p16蛋白對(duì)人喉癌細(xì)胞Hep-2體外生長(zhǎng)和體內(nèi)生長(zhǎng)的影響1.Hep-2細(xì)胞感染重組腺病毒24h,48h,72h,96h后,Ad-p16組Hep-2細(xì)胞的增殖抑制率分別為3.003%±0.497(24h),12.031%±1.946(48h)、24.857%±1.473(72h)和30.35%±1.916(96h),與Ad-LacZ比較,均有顯著性差異；2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,Ad-p16組Hep-2細(xì)胞凋亡率從24h的9.99%增加到26.98%(48h)和37.87%(72h),在Ad-LacZ組和Ad-p16組之間進(jìn)行比較,細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率24h時(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但48h和72h有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；3.電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Ad-p16感染的細(xì)胞染色質(zhì)濃縮和明顯的凋亡小體。而Ad-LacZ感染的Hep-2細(xì)胞少見染色質(zhì)濃縮和凋亡小體。4.與Ad-LacZ比較,Ad-p16感染Hep-2細(xì)胞后24h,使其G0/G1期細(xì)胞明顯增加(48.36%),S期細(xì)胞明顯減少(38.26%),而G2/M期細(xì)胞無明顯變化；5.與Ad-LacZ組比較,促凋亡基因p53、Caspase-8和Bak在Ad-p16組的表達(dá)上調(diào),抑凋亡基因Survivin和bcl-2的表達(dá)下調(diào),均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而Bcl-xl的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；6.與Ad-LacZ組相比較,細(xì)胞周期蛋白p21和cyclinDl基因在Ad-p16組的表達(dá)上調(diào),有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而E2F2和CDK4基因的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；7.裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示untreated組及Ad-LacZ組小鼠腫瘤生長(zhǎng)迅速,且體積與時(shí)間呈一定線性關(guān)系,兩組在各時(shí)間點(diǎn)瘤體體積對(duì)比,均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與Ad-LacZ組比較,Ad-p16治療組的腫瘤體積在12天前均無統(tǒng)計(jì)差異,但16天開始,腫瘤生長(zhǎng)緩慢,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且24天出現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)消退的趨勢(shì)；8.喉癌Hep-2細(xì)胞移植瘤組織Tunnel染色結(jié)果顯示,untreated組Tunnel陽性細(xì)胞百分率為30.56%±1.842, Ad-LacZ組為34.44%±2.572,Ad-p16組為71.78%±3.244,可見Ad-p16組腫瘤組織的凋亡程度明顯增高,與Ad-LacZ組比較,p0.0001。第三部分野生型p16蛋白對(duì)人喉癌細(xì)胞Hep-2與NK細(xì)胞之間相互作用的影響1.用CCK8法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)Hep-2細(xì)胞的殺傷率,結(jié)果顯示,與Ad-LacZ組對(duì)比,不同效靶比的條件下,NK細(xì)胞對(duì)Ad-p16組Hep-2細(xì)胞的殺傷效率均有不同程度的提高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,Ad-p16組Hep-2細(xì)胞表面NK細(xì)胞活化性受體NKG2D的配體MICA/B和ULBP2的表達(dá)均上調(diào),與Ad-LacZ比較,均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；3.采用qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,表達(dá)p16的Hep-2細(xì)胞可下調(diào)IL-10、TGF-β和IL-6的基因表達(dá),上調(diào)IFN-γ的基因表達(dá),與Ad-LacZ比較,均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；4. ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,Ad-p16組培養(yǎng)上清中TGF-p的濃度低于另外兩組,且具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；5.用不同組Hep-2培養(yǎng)上清孵育NKL細(xì)胞后,按照效／靶比4：1的比例,利用CCK8法檢測(cè)NKL的殺傷活性。結(jié)果顯示,單純Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育后的NKL細(xì)胞殺傷Hep-2細(xì)胞的效率為44.80%±1.277,Ad-LacZ處理組的為44.43%±1.241,二者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而Ad-p16組的為77.10%±1.850,與Ad-LacZ組比較,p0.0001。6. Ad-LacZ組培養(yǎng)上清添加anti-TGF-β Ab以阻斷TGF-β的作用,結(jié)果顯示,阻斷后NK細(xì)胞的殺傷活性由44.43%±1.241增加到58.33%±1.525,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Ad-p16組培養(yǎng)上清補(bǔ)充TGF-β蛋白,結(jié)果顯示,補(bǔ)充后NK細(xì)胞的殺傷活性由77.10%±1.850減少到58.73%±2.554,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)論1.人喉癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞缺失p16蛋白的表達(dá),而重組腺病毒Ad-p16感染Hep-2細(xì)胞后,p16蛋白在該細(xì)胞的表達(dá)率可高達(dá)95%左右,補(bǔ)充了Hep-2細(xì)胞缺失的p16蛋白,重組腺病毒Ad-p16可為下一步的實(shí)驗(yàn)研究提供良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。2.野生型p16蛋白在Hep-2細(xì)胞的表達(dá)可使該細(xì)胞體內(nèi)外的生長(zhǎng)均受到抑制；野生型p16蛋白可使Hep-2細(xì)胞停滯于G0/G1期,減少細(xì)胞進(jìn)入S期,說明p16蛋白可通過調(diào)控細(xì)胞周期來發(fā)揮其抑瘤作用；野生型p16蛋白可促進(jìn)Hep-2細(xì)胞的凋亡,且呈時(shí)間依賴性；電子顯微鏡顯示存在經(jīng)典的細(xì)胞凋亡形態(tài)；移植瘤組織‘Tunnel染色也顯示p16蛋白可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,表明p16蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是其發(fā)揮抑瘤作用的另一機(jī)制。3.野生型p16蛋白在Hep-2細(xì)胞的表達(dá),一方面,引起Hep-2細(xì)胞高表達(dá)NKG2D配體,使其對(duì)NK細(xì)胞的殺傷敏感性增加；另一方面,Hep-2細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)生改變,如下調(diào)TGF-β和IL-10,上調(diào)IFN-γ,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)p16蛋白引發(fā)的TGF-β的下調(diào)可使NK細(xì)胞的殺傷活性得到提高。研究意義通過本課題的研究,初步揭示了在p16蛋白抗腫瘤機(jī)制中,存在著兩條不同的作用通路,即抑制腫瘤細(xì)胞自身的生長(zhǎng)速度和促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。對(duì)這兩條途徑的關(guān)系,國內(nèi)外鮮有研究,尚屬于初步探討,不過相信隨著免疫學(xué)和基因治療的發(fā)展,對(duì)于抑瘤基因的抗腫瘤機(jī)制的認(rèn)識(shí)會(huì)越來越深入,將為腫瘤的免疫治療開辟新的道路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.65

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本文編號(hào)：2379038