【摘要】：研究目的 通過建立不同程度的間歇缺氧動(dòng)物模型,模擬不同程度睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(SAHS)患者的缺氧狀態(tài),研究不同程度間歇缺氧對(duì)大鼠腦細(xì)胞凋亡發(fā)生發(fā)展的意義；對(duì)缺氧動(dòng)物模型實(shí)施21%氧干預(yù)后,觀察其對(duì)腦組織病理變化的影響,加深對(duì)SAHS的認(rèn)識(shí),為早期干預(yù)SAHS病情的發(fā)生與發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)；觀察對(duì)間歇缺氧進(jìn)行21%氧干預(yù)后,大鼠腦內(nèi)HIF-1, iNOS表達(dá)的變化,探討二者在間歇缺氧神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用,同時(shí)闡明這一變化對(duì)評(píng)估缺血性腦血管疾病的治療價(jià)值的意義。材料與方法 健康SD大鼠42只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)起始階段：42只中隨機(jī)選取6只作為0周的參考值(A組)。剩余36只大鼠隨機(jī)分為三組,對(duì)照組(n=12)；輕度間歇缺氧組(n=12,相當(dāng)于輕度OSAS, AHI=15);重度間歇缺氧組(n=12,相當(dāng)于重度OSAS, AHI=40),各組以普通飼料、普通飲水飼養(yǎng)60天。每日9：00至16：00時(shí)將各組大鼠置于各實(shí)驗(yàn)箱中,共7h,16:00后使大鼠生活于大氣環(huán)境中。各組在試驗(yàn)30天后隨機(jī)取6只大鼠(BN組,BQ組,BZ組),予以取腦、原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)(TUNEL)、電鏡檢查,應(yīng)用免疫組化,Western Blot對(duì)腦內(nèi)HIF-1α, iNOS進(jìn)行蛋白水平的檢測(cè)。各組剩余大鼠(CN組,CQ組,CZ組)予以正常氧環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng),30天后行上述相同檢查。結(jié)果應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 1.神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化： 1.1HE染色光學(xué)顯微鏡下,神經(jīng)細(xì)胞核呈藍(lán)黑色,胞漿呈淡紅色。A組,BN組SD大鼠海馬區(qū)可見數(shù)層錐體神經(jīng)元,細(xì)胞形態(tài)規(guī)則；BQ, BZ各組中,從形態(tài)學(xué)觀察有不同程度的改變,海馬區(qū)錐體神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮、胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞體急劇變小等現(xiàn)象,以此判斷可能有細(xì)胞凋亡的發(fā)生。經(jīng)過21%氧干預(yù)30天后,試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：干預(yù)組(CQ, CZ組)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況有所好轉(zhuǎn),但部分神經(jīng)元細(xì)胞仍有排列不規(guī)則,形態(tài)改變的情況,未能恢復(fù)至初始水平。 1.2透視電鏡檢查發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過30天間歇缺氧,間歇缺氧組的腦組織病理較正常氧組有顯著變化,且重度間歇缺氧組較輕度間歇缺氧組改變更為明顯,表現(xiàn)為大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞核雙層膜結(jié)構(gòu)破壞,部分線粒體水腫擴(kuò)張,細(xì)胞質(zhì)中可見空泡。經(jīng)過21%氧干預(yù)30天后,干預(yù)組神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況有所好轉(zhuǎn),但部分神經(jīng)細(xì)胞仍有細(xì)胞形態(tài)的變化,未能恢復(fù)至初始水平。 1.3TUNEL實(shí)驗(yàn)顯示：對(duì)照組(A組,BN組)SD大鼠海馬區(qū)可見神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,排列整齊緊密；缺氧組(BQ, BZ)中,被染成棕黃色或棕褐色凋亡細(xì)胞增多,以重度間歇缺氧組增多最為明顯(14.83±2.48VS18.67±2.66VS32.67±4.18VS49.17±4.36)。間歇缺氧組(BQ, BZ組)明顯高于對(duì)照組(A,BN組),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；輕度間歇缺氧組和重度間歇缺氧組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。經(jīng)過21%氧干預(yù)30天后,試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：間歇缺氧干預(yù)組(CQ, CZ組)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況有所好轉(zhuǎn)(24.00±3.90VS31.67±2.50),但未能恢復(fù)至初始水平。間歇缺氧干預(yù)組(CQ, CZ組)高于對(duì)照組(A, BN, CN組),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；和缺氧組(BQ, BZ組)之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。凋亡神經(jīng)細(xì)胞主要集中在海馬區(qū),皮層。 2. iNOS表達(dá)的比較 常氧對(duì)照組(A,BN組)大鼠腦組織內(nèi)散在分布少量iNOS陽性細(xì)胞(23.46±3.5501,24.17±1.4452)。在實(shí)驗(yàn)組,不論是輕度間歇缺氧組還是重度間歇缺氧組均可見較多的著色細(xì)胞(37.01±4.0473,53.34±8.0801)。間歇缺氧組(BQ, BZ組)明顯高于對(duì)照組(A, BN組),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；輕度間歇缺氧組和重度間歇缺氧組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；經(jīng)21%氧干預(yù)30天后,干預(yù)組(CQ, CZ組)腦內(nèi)iNOS陽性染色細(xì)胞表達(dá)恢復(fù)至初始水平(24.6±8.1662,24.77±6.6268),干預(yù)組(CQ,CZ組)和間歇缺氧組(BQ,BZ組)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,和對(duì)照組(A, BN, CN組)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。iNOS陽性染色細(xì)胞主要集中在大腦皮層及海馬區(qū),不僅見于神經(jīng)元,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中亦有表達(dá)。 WestemBlot檢測(cè)結(jié)果顯示：缺氧后,實(shí)驗(yàn)組(BQ, BZ組)iNOS較對(duì)照組(A,BN組)表達(dá)增多,以慢性重度間歇缺氧組最為明顯(140.01±1.7147VS151.52±19.9948VS376.52±38.9234VS585.17±35.1067)。間歇缺氧組(BQ, BZ組)明顯高于對(duì)照組(A,BN組),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；輕度間歇缺氧組(BQ組)和重度間歇缺氧組(BZ組)之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。經(jīng)21%氧干預(yù)30天后,干預(yù)組(CQ, CZ組：170.59±42.5984,172.45±30.2081)和間歇缺氧組(BQ,BZ組)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,和對(duì)照組(A, BN, CN組)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),各組腦內(nèi)iNOS蛋白表達(dá)恢復(fù)至初始水平。 3.HIF-1α表達(dá)的比較 常對(duì)照組(A, BN組)大鼠腦組織內(nèi)HIF-1α呈弱表達(dá),在間歇缺氧組(BQ,BZ組)尤其是重度間歇缺氧組可見著色細(xì)胞明顯增多(12.35±4.7915VS13.55±5.7289VS27.61±4.0600VS36.81±2.4887)。間歇缺氧組(BQ, BZ組)明顯高于對(duì)照組(A,BN組),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；輕度間歇缺氧組和重度間歇缺氧組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P0.01)；經(jīng)21%氧干預(yù)30天后,各組腦內(nèi)HIF-1α陽性染色細(xì)胞表達(dá)恢復(fù)至初始水平,干預(yù)組(CQ, CZ組：13.70±5.2587,14.22±6.5862)和間歇缺氧組(BQ, BZ組)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,和對(duì)照組(A,BN,CN組)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。HIF-1α陽性染色細(xì)胞主要集中在海馬及皮層區(qū)。 WesternBlot檢測(cè)結(jié)果顯示：缺氧后,實(shí)驗(yàn)組(BQ,BZ組)HIF-1α較對(duì)照組(A,BN組)表達(dá)增多,以慢性重度間歇缺氧組最為明顯(112.60±11.2176VS136.26±19.994VS338.25±81.6125VS488.63±86.4614)。間歇缺氧組(BQ,BZ組)明顯高于對(duì)照組(A,BN組),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；輕度間歇缺氧組(BQ組)和重度間歇缺氧組(BZ組)之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。經(jīng)21%氧干預(yù)30天后,干預(yù)組(CQ, CZ組：158.44±10.631,167.79±34.505)和間歇缺氧組(BQ, BZ組)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,和對(duì)照組(A, BN, CN組)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),各組腦內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)恢復(fù)至初始水平。 結(jié)論 1.間歇缺氧易誘導(dǎo)腦內(nèi)特定部位神經(jīng)細(xì)胞凋亡,主要表現(xiàn)為皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加,這可能是SAHS導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的主要原因。 2.不同缺氧方式所導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的程度是不同的,說明神經(jīng)細(xì)胞的凋亡不僅僅是由缺氧本身所致,而且與缺氧的方式有關(guān)。 3.間歇缺氧有效刺激海馬區(qū)iNOS和HIF-1α的蛋白水平高表達(dá),二者共同參與了神經(jīng)系統(tǒng)缺氧應(yīng)答反應(yīng)。不同程度缺氧方式所導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的程度是不同的,其HIF-1α及iNOS在腦內(nèi)的蛋白表達(dá)也不同。 4.缺氧干預(yù)后,腦組織損傷有一定程度的改善,可能與機(jī)體內(nèi)氧自由基代謝恢復(fù)平衡有關(guān)。缺氧程度不同,氧化應(yīng)激強(qiáng)度不同,早期糾正缺氧,改善氧化應(yīng)激狀態(tài),可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R766

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本文編號(hào)：2373775