【摘要】：目的：年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)是西方工業(yè)國家中引起中央視野缺以至于致盲最常見的病因,我國由于人口老齡化,發(fā)病率也有上升。對AMD發(fā)病機制的研究將有助于AMD的防治提供思路。研究表明氧化應激能造成細胞功能紊亂及功能缺損。因此本研究旨在揭示氧化應激狀態(tài)下視網膜色素上皮細胞(retinal pigmented epithelium cells, RPE) SirTl和STAT3之間的相互作用,并探討其在早期AMD發(fā)病機制中的意義。方法：1)人視網膜色素上皮細胞氧化應激損傷模型的建立及氧化應激對RPE損傷的評估。體外培養(yǎng)人ARPE-19細胞系,ox-LDL (200 μg/ml)及H2O2 (50μM)干預培養(yǎng)細胞誘導氧化應激,采用膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶(annexin V-fluorescein isothiocyanate and propidium iodide, AVFI/PI)對細胞增殖和凋亡率進行分析,乙酰乙酸鈉(DCFH-DA)熒光探針檢測細胞內生活性氧(ROS)水平,采用SA-β-gal方法分析評估H202及ox-LDL誘導的RPE細胞衰老水平,從而詳細了解及評估氧化應激對RPE的損傷；2)上一步研究的基礎上,對氧化應激過程中SirT1mRNA表達進行分析研究。H202干預后Real-Time熒光定量PCR(qRT-PCR)對RPE細胞SIRT1 mRNA表達變化進行分析；3) SirT1保護RPE抗氧化應激損傷。采用SirT1激動劑白藜蘆醇(RSV)及抑制劑煙酰胺(NA)分別預處理RPE細胞,經H2O2 (50 μM)及ox-LDL (200 Rg/ml)干預后通過對增殖、凋亡、ROS及細胞衰老狀態(tài)的分析,使用靶向siRNA對SIRT1進行敲除,作為陰性對照,從而深入了解SIRT1抗RPE氧化應激效果；4)通過gain and loss功能研究深入分析SirTl/STAT3相互作用對暴露于氧化應激狀況下RPE細胞的影響。Western Blot法檢測在敲除或上調SIRT1表達后STAT3基因表達及蛋白表達的影響。結果：1氧化應激能造成RPE損傷,并導致SirT1和STAT3功能紊亂為模擬AMD病程中的氧化損傷,H202和ox-LDL作為外源性氧化劑誘導RPE的病理性應激。H202和ox-LDL分別干預RPE細胞24后,分析細胞的增殖、凋亡和內生活性氧及ARPE-19細胞的衰老狀況。研究表明H202和ox-LDL干預后,細胞的增值率顯著下降而凋亡率顯著升高、ROS水平顯著升高并促使細胞衰老增加。為評價SirT1與STAT3在氧化應激中的作用,我們對SirT1和STAT3在RPE中的表達進行分析。我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比,H2O2和ox-LDL干預RPE之后SirT1 mRNA表達量顯著下調,與之相反的是,STATS mRNA表達量是顯著上升的。這些結果證明氧化應激誘導RPE損傷并造成SirT1和STAT3 mRNA表達失調。2. SirT1保護RPE抗氧化應激損傷RPE分別用SirT1抑制劑NA、SirT1激活劑RSV預處理,隨后用H2O2(50μM)和ox-LDL (200 μg/ml)干預24小時。最終進行ARPE-19細胞的增殖、凋亡細胞內ROS和RPE衰老分析。結果提示,NA提高H2O2的毒性作用,顯著減低增值率,刺激凋亡,使ROS累積和衰老增加。同NA的作用相比SirT1激活劑RSV,表現(xiàn)出顯著的抗H2O2毒性作用。而ox-LDL誘導RPE存在相似的研究結論作。氧化應激過程中,SirT1能負向調節(jié)STAT3的表達本研究探討了SirT1與STAT3活化之間的相關性,通過觀察SirT1基因敲除后STAT3的表達差異,及氧化應激過程中STAT3的過表達分析,深入研究SirT1在RPE氧化應激過程中的防護作用.SirT1激活劑白藜蘆醇RSV顯著降低STAT3表達量,但當SirT1基因敲除之后,我們發(fā)現(xiàn)同H2O2干預組與對照組相比,RPE的STAT3表達量顯著上升。更進一步地,我們發(fā)現(xiàn)SirT1基因敲除能提高氧化應激過程中STAT3蛋白和磷酸化STAT3蛋白表達；而缺乏氧化應激的刺激劑RSV與SirT1基因敲除并不能影響STAT3的表達。反之我們也分析了STAT3基因敲除狀態(tài)下RPE的SirT1表達及氧化應激狀態(tài)下的SirT1表達。通過Western blot分析檢測每組STAT3蛋白表達。氧化應激狀態(tài)下,同C-STAT3OV相比,STAT3過表達能顯著導致SirT1表達下降。而STAT3KO組SirT1表達量顯著增加。這些結果表明氧化應激狀態(tài)下STATS對RPE的SirT1表達產生負向調節(jié)作用。STATS能保護ARPE-19細胞抗氧化應激損傷,獨立調節(jié)細胞衰老為深入了解氧化應激狀態(tài)下STAT3及SirT1對RPE細胞的防護效果的相關性,因此我們研究了SirT1抑制劑NA預處理RPE后STAT3抗氧化效果. STAT3增強NA組細胞增殖能力,減少細胞凋亡,并導致內生ROS增加。然而, STAT3并不能影響細胞衰老。上述結果表明STAT3具有直接的保護細胞抗氧化應激作用,而并非依賴SirT1活性；同時證實氧化應激狀態(tài)下STAT3防護作用同細胞衰老的調節(jié)作用沒有關聯(lián)。綜上所述,本研究認為由于SirT1和STAT3之間特殊的相互作用,因此在抗氧化應激過程中SirT1和STAT3功能之間存在一種平衡機制。結論：1.外源性氧化劑H2O2和ox-LDL可誘導人視網膜色素上皮細胞ARPE-19細胞發(fā)生氧化應激反應,導致顯著的細胞氧化損傷,如增值下降、凋亡增加,ROS水平身高及細胞衰老顯著。2.氧化應激損傷能造成SirT1和STAT3功能紊亂從而導致RPE損傷。3. STAT3能保護ARPE-19細胞抗氧化應激損傷,獨立調節(jié)細胞衰老。4.氧化應激過程中SirT1對STAT3表達起到負向調節(jié)作用。而SirT1和STAT3對RPE起到了抗氧化應激的作用。以上這些結果提示在抗氧化應激的過程中SirT1和STAT3之間存在平衡機制,提示在AMD的治療過程中需聯(lián)合應用SirT1和STAT3。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R774.5

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本文編號：2370455