【摘要】：目的晶狀體后囊膜混濁(posterior capsule opacification,PCO)是白內(nèi)障術(shù)后最常見的并發(fā)癥。該過程被認為是手術(shù)啟動了晶狀體的異常損傷修復(fù)反應(yīng),進而誘發(fā)晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells,LECs)在后囊膜上增生、移行,并出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition,EMT)和晶狀體纖維再生。晶狀體上皮損傷影響了晶狀體自身獨有的電流環(huán)路,產(chǎn)生傷口電位和電場,增加赤道部LECs的增殖。所以有人認為白內(nèi)障手術(shù)破壞了晶狀體正常的電流形式和內(nèi)在的電場,使LECs失去晶狀體原有電流及電場的調(diào)節(jié)作用,導(dǎo)致LECs發(fā)生EMT,這可能是PCO發(fā)生的部分原因。本實驗通過建立電場對人晶狀體上皮細胞系HLE-B3細胞的體外作用模型,觀察電場對HLE-B3細胞的生物學(xué)效應(yīng),如凋亡、增生、形態(tài)及細胞周期的影響,并檢測電場對HLE-B3細胞內(nèi)EMT標(biāo)志物表達的影響及電場誘導(dǎo)HLE-B3細胞發(fā)生EMT的作用機制。方法1)體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞系HLE-B3細胞,并根據(jù)文獻描述建立電場對HLE-B3細胞的作用模型;將細胞分別暴露于電場強度為50-150mV/mm的電場中,顯微照相系統(tǒng)記錄電場作用前、作用6h、12h及24h的細胞圖像;流式細胞儀檢測各時間點細胞凋亡情況并選擇合適的電壓。電壓為100mV/mm時,觀察電場對HLE-B3細胞增生的影響;流式細胞儀測定細胞周期。2)運用qRT-PCR技術(shù)檢測電場對HLE-B3細胞中EMT標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin及integrinβ1基因表達的影響;運用免疫熒光及Western blot實驗檢測電場對HLE-B3細胞中EMT標(biāo)志物E-cadherin,Vimentin及integrinβ1蛋白表達的影響。3)分別加入integrinβ1抑制劑MAB1965和FAK抑制劑PF-573,228,觀察HLE-B3細胞形態(tài)的變化及EMT標(biāo)志物基因、蛋白表達的變化,進一步探明電場誘導(dǎo)LECs發(fā)生EMT與integrinβ1-FAK信號通路之間的關(guān)系。結(jié)果1)成功建立了電場對HLE-B3細胞的作用模型。50mV/mm的電場暴露組中,細胞形態(tài)未見明顯變化。100mV/mm、150mV/mm的電場暴露中,細胞間隙增加,細胞胞體伸長、呈紡錘樣,且細胞長軸轉(zhuǎn)向垂直于場線的方向。流式細胞儀檢測結(jié)果進一步顯示,150mV/mm電場強度可誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。100mV/mm的電場暴露組中,細胞的增殖受到明顯的抑制,表現(xiàn)為細胞周期由G1期向S期過渡的抑制。2)分別應(yīng)用免疫熒光、qRT-PCR法和Western blot檢測EF對EMT標(biāo)志物表達的影響。qRT-PCR法、免疫熒光和Western blot實驗結(jié)果顯示:電場誘導(dǎo)HLE-B3細胞上皮標(biāo)志物E-cadherin的基因和蛋白表達下調(diào),間質(zhì)細胞標(biāo)志物Vimentin基因和蛋白表達上調(diào)。3)電場誘導(dǎo)HLE-B3細胞integrinβ1表達的上調(diào)和FAK的活化。電場聯(lián)合integrinβ1抑制劑MAB1965作用HLE-B3細胞后,細胞形態(tài)未發(fā)生明顯的改變,Western blot檢測結(jié)果顯示E-cadherin和Vimentin的蛋白表達與對照組相比,無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。而電場聯(lián)合FAK抑制劑PF-573,228作用后,細胞形態(tài)依舊出現(xiàn)在電場作用下伸長的趨勢。Western blot檢測結(jié)果顯示E-cadherin蛋白表達下調(diào)、Vimentin蛋白表達上調(diào),與對照組相比,有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論1)100mV/mm的電場引起HLE-B3細胞發(fā)生EMT的形態(tài)學(xué)改變,并誘發(fā)細胞凋亡,抑制HLE-B3細胞的增殖,抑制其細胞周期由G1期向S期的過渡。2)電場誘導(dǎo)HLE-B3細胞發(fā)生EMT,該過程伴有integrinβ1和FAK的表達上調(diào)。3)integrinβ1-FAK信號通路至少部分的參與電場誘導(dǎo)HLE-B3細胞發(fā)生EMT的過程。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R779.6
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本文編號：2350207