【摘要】：目的晶狀體后囊膜混濁(posterior capsule opacification,PCO)是白內(nèi)障術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥。該過(guò)程被認(rèn)為是手術(shù)啟動(dòng)了晶狀體的異常損傷修復(fù)反應(yīng),進(jìn)而誘發(fā)晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells,LECs)在后囊膜上增生、移行,并出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition,EMT)和晶狀體纖維再生。晶狀體上皮損傷影響了晶狀體自身獨(dú)有的電流環(huán)路,產(chǎn)生傷口電位和電場(chǎng),增加赤道部LECs的增殖。所以有人認(rèn)為白內(nèi)障手術(shù)破壞了晶狀體正常的電流形式和內(nèi)在的電場(chǎng),使LECs失去晶狀體原有電流及電場(chǎng)的調(diào)節(jié)作用,導(dǎo)致LECs發(fā)生EMT,這可能是PCO發(fā)生的部分原因。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立電場(chǎng)對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3細(xì)胞的體外作用模型,觀察電場(chǎng)對(duì)HLE-B3細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng),如凋亡、增生、形態(tài)及細(xì)胞周期的影響,并檢測(cè)電場(chǎng)對(duì)HLE-B3細(xì)胞內(nèi)EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響及電場(chǎng)誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞發(fā)生EMT的作用機(jī)制。方法1)體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3細(xì)胞,并根據(jù)文獻(xiàn)描述建立電場(chǎng)對(duì)HLE-B3細(xì)胞的作用模型;將細(xì)胞分別暴露于電場(chǎng)強(qiáng)度為50-150mV/mm的電場(chǎng)中,顯微照相系統(tǒng)記錄電場(chǎng)作用前、作用6h、12h及24h的細(xì)胞圖像;流式細(xì)胞儀檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡情況并選擇合適的電壓。電壓為100mV/mm時(shí),觀察電場(chǎng)對(duì)HLE-B3細(xì)胞增生的影響;流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。2)運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)電場(chǎng)對(duì)HLE-B3細(xì)胞中EMT標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin及integrinβ1基因表達(dá)的影響;運(yùn)用免疫熒光及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)電場(chǎng)對(duì)HLE-B3細(xì)胞中EMT標(biāo)志物E-cadherin,Vimentin及integrinβ1蛋白表達(dá)的影響。3)分別加入integrinβ1抑制劑MAB1965和FAK抑制劑PF-573,228,觀察HLE-B3細(xì)胞形態(tài)的變化及EMT標(biāo)志物基因、蛋白表達(dá)的變化,進(jìn)一步探明電場(chǎng)誘導(dǎo)LECs發(fā)生EMT與integrinβ1-FAK信號(hào)通路之間的關(guān)系。結(jié)果1)成功建立了電場(chǎng)對(duì)HLE-B3細(xì)胞的作用模型。50mV/mm的電場(chǎng)暴露組中,細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯變化。100mV/mm、150mV/mm的電場(chǎng)暴露中,細(xì)胞間隙增加,細(xì)胞胞體伸長(zhǎng)、呈紡錘樣,且細(xì)胞長(zhǎng)軸轉(zhuǎn)向垂直于場(chǎng)線(xiàn)的方向。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步顯示,150mV/mm電場(chǎng)強(qiáng)度可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。100mV/mm的電場(chǎng)暴露組中,細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制,表現(xiàn)為細(xì)胞周期由G1期向S期過(guò)渡的抑制。2)分別應(yīng)用免疫熒光、qRT-PCR法和Western blot檢測(cè)EF對(duì)EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響。qRT-PCR法、免疫熒光和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:電場(chǎng)誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherin的基因和蛋白表達(dá)下調(diào),間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin基因和蛋白表達(dá)上調(diào)。3)電場(chǎng)誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞integrinβ1表達(dá)的上調(diào)和FAK的活化。電場(chǎng)聯(lián)合integrinβ1抑制劑MAB1965作用HLE-B3細(xì)胞后,細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯的改變,Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示E-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比,無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。而電場(chǎng)聯(lián)合FAK抑制劑PF-573,228作用后,細(xì)胞形態(tài)依舊出現(xiàn)在電場(chǎng)作用下伸長(zhǎng)的趨勢(shì)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)、Vimentin蛋白表達(dá)上調(diào),與對(duì)照組相比,有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論1)100mV/mm的電場(chǎng)引起HLE-B3細(xì)胞發(fā)生EMT的形態(tài)學(xué)改變,并誘發(fā)細(xì)胞凋亡,抑制HLE-B3細(xì)胞的增殖,抑制其細(xì)胞周期由G1期向S期的過(guò)渡。2)電場(chǎng)誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞發(fā)生EMT,該過(guò)程伴有integrinβ1和FAK的表達(dá)上調(diào)。3)integrinβ1-FAK信號(hào)通路至少部分的參與電場(chǎng)誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞發(fā)生EMT的過(guò)程。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R779.6
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本文編號(hào)：2350207