【摘要】：糖尿病(diabetes mellitus,DM)為臨床上比較常見的內(nèi)分泌代謝性疾病,是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率較高的五大疾病之一。伴隨當代經(jīng)濟快速發(fā)展以及生活水平的提高,DM的發(fā)生率正在呈快速上升趨勢,預計2025年將增長至3.5億人。糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)是DM最常見的并發(fā)癥之一,已經(jīng)成為DM患者視力減弱乃至失明的重要原因,嚴重影響患者生活質(zhì)量。因此深入探索DR的發(fā)病機制,為臨床尋找新的方法治療DR具有重大意義。有文獻報道,鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中出現(xiàn)大量空泡樣變,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells,RGCs)胞體腫脹,數(shù)目顯著減少,并發(fā)生明顯凋亡。同時越來越多的研究證實,在DM早期出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞病變,并伴隨RGCs損傷、凋亡、結(jié)構(gòu)改變及功能狀態(tài)減退。眾所周知,RGCs是唯一的視覺輸出細胞,且RGCs軸突是視神經(jīng)的重要組成部分,因此RGCs受損、凋亡及再生修復是DR發(fā)病及視力減退的重要機制之一。盡管國內(nèi)外目前對糖尿病RGCs已經(jīng)展開了大量研究,但RGCs損傷、凋亡、再生受抑的原因及具體分子機制并未完全明確,仍需進一步探索。近年研究發(fā)現(xiàn),軸突生長抑制因子蛋白受體(Nogo receptor,Ng R)在視神經(jīng)節(jié)細胞的損傷、修復及再生中發(fā)揮關鍵作用。將其干擾后能有效恢復大鼠RGCs細胞活力,促進細胞增殖,抑制細胞凋亡。本課題組前期工作表明,DR病理條件下,視網(wǎng)膜組織中Ng R及Rock1蛋白表達明均顯上調(diào),提示Ng R-Rho A-Rock1信號通路在DR狀態(tài)下被激活。此外,Rho A/Rock信號通路激活后作用于細胞骨架蛋白(F-actin),進而抑制軸突末端生長錐的延伸及神經(jīng)節(jié)再生。而將該信號上游蛋白Ng R抑制后可以恢復視網(wǎng)膜受損后的軸突再生功能,抑制RGCs凋亡。表明Ng R-Rho ARock1信號通路亦很可能參與調(diào)控糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞受損、凋亡及再生過程。睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)是一種多效神經(jīng)營養(yǎng)因子,可以滋養(yǎng)神經(jīng)節(jié)細胞并促進軸突生長。視網(wǎng)膜局部神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏難以維持RGCs生存,是導致DR患者視力下降的又一重要因素。有研究證實CNTF對外傷性視神經(jīng)損傷RGCs具有明顯保護作用,而外源性給予CNTF可明顯保護遺傳性糖尿病小鼠及Ⅰ型糖尿病大鼠的視力。提示,CNTF在視神經(jīng)修復、軸突再生及神經(jīng)節(jié)細胞凋亡中扮演重要角色,但其對糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的影響及調(diào)控機制目前國內(nèi)外仍知之甚少。綜上,本課題擬通過體內(nèi)、外實驗研究si Ng R及CNTF對糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞生存及再生的影響,并探討兩者是否存在協(xié)同作用以及相關分子調(diào)控機制。期望能為DR臨床治療提供可靠的實驗依據(jù)以及新型治療方案。第一部分Ng R干擾及CNTF預處理對高糖誘導的RGC-5凋亡的影響目的:明確si Ng R及CNTF對高糖誘導的大鼠RGC-5增殖、損傷及凋亡的影響。方法:RGC-5轉(zhuǎn)染si Ng R或給予CNTF預處理,高糖誘導建立細胞損傷模型。實驗設置對照組、高糖組、高糖+NC組、高糖+si Ng R組、高糖+CNTF組、高糖+CNTF+si Ng R組。細胞培養(yǎng)48 h后,采用MTT實驗檢測細胞增殖變化,流式細胞術(shù)分析細胞凋亡情況,Real-time PCR及Western blot檢測Ng R及其下游Rho A、Rock1 m RNA和蛋白的表達,免疫熒光技術(shù)對RGCs特異性標志物及突起長度進行定量分析。結(jié)果:MTT及流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,高糖導致RGC-5細胞增殖能力顯著降低,凋亡數(shù)量明顯增加(P0.01),而si Ng R轉(zhuǎn)染或CNTF預處理后RGC-5細胞的增殖能力顯著提高,凋亡數(shù)量明顯減少(P0.01),且si Ng R與CNTF存在協(xié)同作用;Real-time PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示,Ng R、Rho A及Rock1 m RNA及蛋白在細胞模型中的表達顯著增加(P0.01),而si Ng R轉(zhuǎn)染或CNTF預處理后三者表達水平均顯著下降(P0.01),且si Ng R與CNTF存在協(xié)同作用;免疫熒光檢測結(jié)果顯示,經(jīng)高糖誘導后RGCs細胞突起變短,標志物表達水平顯著下降(P0.01),而si Ng R轉(zhuǎn)染或CNTF可以提高標志物的表達,增加細胞突起長度,且si Ng R與CNTF存在協(xié)同作用。結(jié)論:Ng R干擾或外源性給予CNTF可以協(xié)同保護RGC-5,促進受損細胞存活,抑制細胞凋亡,且同Ng R-Rho A-Rock1信號通路密切相關。第二部分si Ng R及CNTF對糖尿病大鼠RGCs凋亡及再生的影響目的:明確玻璃體內(nèi)注射si Ng R或CNTF對糖尿病大鼠RGCs凋亡及再生的影響。方法:腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型,成功誘導后玻璃體內(nèi)局部注射si Ng R或CNTF進行干預,實驗設置對照組、糖尿病組、糖尿病+NC組、糖尿病+si Ng R組、糖尿病+CNTF組,糖尿病+CNTF+si Ng R組。12周后取各組大鼠視網(wǎng)膜組織,采用HE染色觀察神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量及形態(tài),TUNEL法分析RGCs凋亡率,Western blot檢測細胞凋亡及軸突再生相關蛋白的表達,Real-time PCR及免疫組化技術(shù)進一步驗證軸突再生標志物m RNA及蛋白表達水平變化。結(jié)果:HE染色及TUNEL檢測結(jié)果顯示,糖尿病大鼠RGCs層空泡化,數(shù)量明顯減少,凋亡率顯著上升(P0.01),而玻璃體內(nèi)注射si Ng R或CNTF后RGCs數(shù)量明顯增加,凋亡率顯著下降(P0.01),且si Ng R與CNTF存在協(xié)同作用。Western blot檢測結(jié)果顯示,糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、caspase-3的表達顯著增加,Bcl-2及F-actin、GAP-43的表達明顯減少(P0.01),而玻璃體內(nèi)注射si Ng R或CNTF可以明顯逆轉(zhuǎn)上述指標的表達,且si Ng R與CNTF存在協(xié)同作用;Real-time PCR及免疫組化實驗進一步證實了si Ng R或CNTF可以顯著增加軸突再生標志物Factin、GAP-43 m RNA及蛋白的表達。結(jié)論:si Ng R和CNTF可以協(xié)同促進糖尿病大鼠RGCs存活,誘導軸突再生,抑制細胞凋亡。第三部分si Ng R及CNTF影響糖尿病RGCs凋亡及再生的分子機制目的:明確si Ng R或CNTF對糖尿病大鼠RGCs的影響是否同Ng RRho A-Rock1信號通路有關。方法:腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型,藥物治療及實驗分組同第二章。16周后收集各組大鼠視網(wǎng)膜組織,采用Real-time PCR及Western blot技術(shù)檢測Ng R、Rho A、Rock1 m RNA及蛋白的表達。結(jié)果:Real-time PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示,糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中Ng R、Rho A、Rock1 m RNA及蛋白的表達顯著增加(P0.01),而玻璃體內(nèi)注射si Ng R或CNTF后三個指標的表達水平均顯著下降(P0.01),且si Ng R與CNTF存在協(xié)同作用。結(jié)論:si Ng R和CNTF可以協(xié)同抑制Ng R-Rho A-Rock1信號通路激活,誘導RGCs再生,抑制細胞凋亡。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R774.1;R587.2

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