【摘要】：背景： 感音神經性耳聾是一種常見的感覺障礙性疾病,其中先天性重度感音神經性耳聾的發(fā)生率約為千分之一,嚴重困擾著人類的健康、生活與交流。但是,現有的治療手段卻很有限,主要是助聽器和電子耳蝸植入。助聽器對于中度的耳聾有一定效果,但實際上只有五分之一的人才能從中獲益。對于重度感音神經性聾,主要依靠電子耳蝸植入,通過插入耳蝸鼓階內的電極直接刺激聽神經來重建聾人的聽覺功能,全世界已有超過300000患者因此獲益。但它是一種侵入性的手術治療,在噪聲環(huán)境下的言語識別率還有待進一步提高。助聽器和電子耳蝸只能作為補償手段改善患者聽力,不能從根本上重建受損的聽覺生理功能,逆轉患者的聽力水平。近年來生物治療方法在內耳細胞保護、修復和再生方面展現出了巨大的潛能,主要有干細胞移植、基因治療以及生長因子治療等。 骨髓間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是骨髓中除了造血干細胞以外的另一類具有多系分化潛能、強大自我復制能力和可移植性的成體干細胞。在適宜的微環(huán)境下,MSCs可以定向誘導分化為多種組織和細胞類型,如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞,還可跨胚層分化為神經細胞、心肌細胞、血管內皮細胞、肝細胞等。由于MSCs來源廣泛、容易分離培養(yǎng)、免疫原性低等特點,被廣泛應用于細胞移植及基因治療中。 生長因子是一種促進特定細胞生長的細胞因子,能和細胞膜表面的特異性受體結合從而激活細胞內信號通路發(fā)揮作用,它們對多種器官的不同類型細胞的存活、增殖、分化都有調控作用。在內耳發(fā)育成熟過程中可檢測到胰島素樣生長因子1(Insulin-like Growth Factor1, IGF1)、表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)和成纖維細胞生長因子2(Fibroblast Growth Factor2, FGF2)三種生長因子及其受體的表達,這些生長因子可保護內耳毛細胞免受損害并促進內耳毛細胞的增殖分化。 在感音神經性耳聾生物治療中,誘導干細胞向內耳毛細胞樣細胞分化的研究常采用干細胞與一些特定組織細胞共培養(yǎng)以及添加外源性生長因子的方法。為了將兩種方法結合用于研究,本文設計了一種可同時表達三種活化型生長因子的慢病毒載體并用于構建穩(wěn)定轉染的細胞,試圖為干細胞移植結合生長因子治療感音神經性耳聾提供基礎。 1、建立表達三種活化型生長因子的細胞系 活化型EGF編碼序列采用RT-PCR方法從SW620人大腸癌細胞中克隆,活化型IGF1和FGF2編碼序列為人工合成。用PCR的方法分別從pSecTag2A和pIRES2-EGFP質粒中克隆出引導分泌的免疫球蛋白Igκ鏈信號肽編碼序列和引導翻譯的內部核糖體進入位點(Internal Ribosome Entry Site, IRES)序列。將Igκ鏈信號肽和三種因子的編碼序列分別融合、由IRES間隔并克隆到帶綠熒光蛋白報告基因的慢病毒表達質粒pLVX-IRES-ZsGreenl上并包裝獲得慢病毒。將慢病毒感染HEK293T細胞,通過有限稀釋法篩選出穩(wěn)定表達綠熒光蛋白的單細胞克隆,命名為HEK293T/3GF.用Western blot檢測單細胞克隆的IGF1、EGF和FGF2的表達,并通過促進肺癌A549細胞生長實驗驗證分泌的生長因子的活性。 2、共培養(yǎng)誘導骨髓間充質干細胞向內耳毛細胞樣細胞分化 利用構建成功的可同時表達三種活化型生長因子的HEK293T/3GF細胞與MSCs進行共培養(yǎng),探索其在內耳誘導分化中的作用。采用全骨髓貼壁篩選法分離提取大鼠MSCs,體外培養(yǎng)純化擴增到第四代后,與表達活化型生長因子的HEK293T/3GF細胞及未轉染的HEK293T細胞進行共培養(yǎng),并添加維甲酸(Retinoic Acid, RA),共培養(yǎng)21天后,顯微鏡下觀察MSCs;形態(tài)變化,RT-PCR;檢測毛細胞相關標記表達情況。HEK293T/3GF與MSCs共培養(yǎng)組與對照組相比,顯微鏡下可觀察到細胞形態(tài)向神經細胞樣改變,而且RT-PCR結果顯示,HEK293T/3GF與MSCs共培養(yǎng)后MSCs表達毛細胞相關標記,說明HEK293T/3GF與MSCs共培養(yǎng)可以誘導MSCs向內耳毛細胞樣細胞分化。 結論： 本課題成功構建了可同時表達活化型IGF1、EGF和FGF2的慢病毒載體,并獲得穩(wěn)定表達三種因子的HEK293T/3GF細胞,該細胞與MSCs共培養(yǎng)顯示出誘導分化作用,為進一步的內耳細胞治療提供了新的方法。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R764.431

【參考文獻】

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本文編號：2278520