【摘要】：背景阻塞性睡眠呼吸綜合征(obstructive sleep apnea syndrome,OSAS)是一種常見的睡眠呼吸障礙性疾病,是在睡眠過程中反復(fù)發(fā)生的阻塞性低通氣或呼吸暫停。間歇性低氧(intermittent hypoxia,IH)被認(rèn)為是OSAS的主要特征和重要損傷機(jī)制,是引發(fā)一系列心血管疾病的關(guān)鍵因素。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在許多病理生理刺激下(如氧化應(yīng)激、缺血、缺氧)都可以發(fā)生,尤其是參與OSAS相關(guān)的疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、缺血性心肌病等的發(fā)生。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與OSAS患者的血管內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)。除了細(xì)胞死亡受體和線粒體依賴的細(xì)胞凋亡途徑,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被發(fā)現(xiàn)是誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的另一種途徑。因此,我們推測(cè)間歇性低氧可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷引起血管功能紊亂。目的1.建立IH小鼠模型,應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑,觀察IH對(duì)小鼠血壓和血管舒張功能的影響及IH小鼠胸主動(dòng)脈中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá);2.建立血管內(nèi)皮細(xì)胞IH模型,觀察不同程度的間歇性低氧對(duì)細(xì)胞損傷的影響,并且研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在不同程度間歇性低氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制,為防治間歇性低氧導(dǎo)致的血管內(nèi)皮功能障礙提供依據(jù)。方法實(shí)驗(yàn)將雄性健康昆明小鼠分為正常對(duì)照(Control)組、間歇性低氧(IH)組和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(4-PBA)干預(yù)(IH+4-PBA)組,采用套尾法無創(chuàng)測(cè)量小鼠尾動(dòng)脈收縮壓(SBP),用血管張力測(cè)定技術(shù)(myography)檢測(cè)小鼠胸主動(dòng)脈的功能,采用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Bolt)的方法檢測(cè)胸主動(dòng)脈中GRP78和CHOP蛋白表達(dá)情況。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)分為正常培養(yǎng)(IH 0 h)組、IH 6 h組、IH 12 h組和IH 24 h組,并且對(duì)每組應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA,用Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞的活力,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況,用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法測(cè)定內(nèi)皮型一氧化氮合酶(e NOS)的含量。1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在間歇性低氧誘發(fā)小鼠血壓升高中的作用將雄性健康昆明小鼠分為正常對(duì)照(Control)組、間歇性低氧(IH)組和間歇性低氧4-PBA干預(yù)(IH+4-PBA)組,IH組和IH+4-PBA組放入低氧倉進(jìn)行間歇性低氧處理,每天8 h,連續(xù)28 d,間歇性低氧處理最后一周給予小鼠腹腔注射4-PBA(100mg/kg/d),Control組不放入低氧倉,其余條件和處理組相同。28天后采用套尾法無創(chuàng)測(cè)量小鼠尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)。2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在間歇性低氧引起的小鼠血管內(nèi)皮功能障礙中的作用采用離體血管張力測(cè)定的方法檢測(cè)三組小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張和內(nèi)皮非依賴性舒張變化情況,觀察小鼠動(dòng)脈的舒縮功能變化。3.間歇性低氧對(duì)小鼠胸主動(dòng)脈中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響采用Western Bolt法檢測(cè)三組小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和CHOP蛋白的表達(dá)水平。4.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在間歇性低氧對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力影響中的作用將HUVECs正常培養(yǎng)12 h后,換成無血清培養(yǎng)液。設(shè)IH 0 h組、IH6 h組、IH12 h組和IH24 h組,并且對(duì)每組應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑4-PBA(2 mmol/L),用Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞的活力,觀察間歇性低氧及應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA對(duì)細(xì)胞活力的影響。5.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在間歇性低氧對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡影響中的作用將HUVECs分為IH 0 h組、IH6 h組、IH12 h組和IH24 h組,并且對(duì)每組應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑4-PBA,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡變化情況。6.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在間歇性低氧對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)e NOS含量影響中的作用用ELISA法測(cè)量各組細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(e NOS)的含量,觀察間歇性低氧和4-PBA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的e NOS含量的影響。結(jié)果1.間歇性低氧可以導(dǎo)致小鼠血壓升高,其作用可被4-PBA抑制。2.間歇性低氧可以導(dǎo)致小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張減弱,4-PBA可改善IH小鼠的胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能;內(nèi)皮非依賴性舒張無差異。3.間歇性低氧導(dǎo)致小鼠胸主動(dòng)脈GRP78表達(dá)下降,4-PBA導(dǎo)致其表達(dá)增加,CHOP蛋白表達(dá)增加,4-PBA導(dǎo)致其表達(dá)下降。4.間歇性低氧可以使HUVECs活力下降,其作用可被4-PBA抑制;5.間歇性低氧6 h細(xì)胞凋亡沒有發(fā)生變化,長(zhǎng)時(shí)間間歇性低氧(12 h和24 h)使細(xì)胞凋亡增加,應(yīng)用4-PBA可以抑制間歇性低氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡;6.長(zhǎng)時(shí)間間歇性低氧(12 h和24 h)可以使內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的e NOS含量減少,其作用可被4-PBA抑制。結(jié)論間歇性低氧可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,引起細(xì)胞凋亡、細(xì)胞e NOS水平降低和血管舒張功能減退,導(dǎo)致血壓升高。
[Abstract]:BACKGROUND Obstructive sleep apnea syndrome (OSAS) is a common sleep-related respiratory disorder, which occurs repeatedly during sleep with obstructive hypopnea or apnea. Intermittent hypoxia (IH) is considered to be the main feature and important injury mechanism of OSAS, and is the primary cause of OSAS. Endoplasmic reticulum stress can occur under many pathophysiological stimuli, such as oxidative stress, ischemia and hypoxia, especially in OSAS-related diseases such as atherosclerosis, diabetes, ischemic cardiomyopathy. Endothelial cell apoptosis is closely related to vascular endothelial dysfunction in OSAS patients. Endoplasmic reticulum stress has been found to be another way of inducing endothelial cell apoptosis. Therefore, we speculate that intermittent hypoxia may induce vascular dysfunction by endothelial cell injury mediated by endoplasmic reticulum stress. Objective 1. To establish an IH mouse model and apply endoplasmic reticulum stress. Inhibitors, to observe the effects of IH on blood pressure and vasodilator function in mice and the relative expression of ER stress-related proteins in thoracic aorta of IH mice; 2. To establish vascular endothelial cell IH model, to observe the effect of intermittent hypoxia on cell injury, and to study the fine endoplasmic reticulum stress induced by intermittent hypoxia in different degrees. Methods The male healthy Kunming mice were divided into normal control group, intermittent hypoxia (IH) group and endoplasmic reticulum stress inhibitor 4-phenylbutyric acid (4-PBA) intervention group. Systolic blood pressure (SBP) was measured by myography. The expression of GRP78 and CHOP in thoracic aorta was detected by Western Bolt. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were divided into normal culture (IH 0 h), IH 6 h, IH 12 h and IH 2 groups by cell experiment. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) was used to detect cell viability. Cell apoptosis was detected by flow cytometry. The content of endothelial nitric oxide synthase (e NOS) was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). 1. Blood pressure was induced by endoplasmic reticulum stress in intermittent hypoxia in mice. Male healthy Kunming mice were divided into normal control group, intermittent hypoxia (IH) group and intermittent hypoxia 4-PBA intervention (IH+4-PBA) group. IH group and IH+4-PBA group were put into hypoxic chamber for intermittent hypoxia treatment, 8 hours a day for 28 days, intermittent hypoxia treatment was given intraperitoneal injection of 4-PBA (100mg/kg/d) for the last week. Endoplasmic reticulum stress was used to detect endothelial dysfunction induced by intermittent hypoxia in mice. Endothelial relaxation of thoracic aorta in three groups was measured by in vitro vascular tension measurement. Effects of intermittent hypoxia on the expression of ER stress-related proteins in thoracic aorta of mice were detected by Western Bolt method. The expression levels of ER stress-related proteins GRP78 and CHOP in thoracic aorta of three groups of mice were detected. Effects of intermittent hypoxia on the viability of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) After 12 hours of normal culture, HUVECs were replaced with serum-free medium. IH 0 h group, IH 6 h group, IH 12 h group and IH 24 h group were set up. Endoplasmic reticulum inhibitor 4-PBA (2 mmol/L) and Cell Counting Kit-8 (CCK-8) were used to detect the viability of HUVECs and observe intermittent hypoxia and stress. The effect of ER stress on the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells was studied. 5. The effects of ER stress on the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells were divided into IH 0 h group, IH 6 h group, IH 12 h group and IH 24 h group. Effect of endoplasmic reticulum stress on the content of E NOS in human umbilical vein endothelial cells under intermittent hypoxia Intermittent hypoxia can reduce the endothelium-dependent relaxation of thoracic aorta in mice. 4-PBA can improve the endothelium-dependent relaxation of thoracic aorta in IH mice. Endothelial-independent relaxation has no difference. 3. Intermittent hypoxia can decrease the expression of GRP78 in thoracic aorta, 4-PBA can increase the expression of GRP78 and CHOP protein. Intermittent hypoxia can inhibit the activity of HUVECs, which can be inhibited by 4-PBA. 5. Intermittent hypoxia can inhibit the apoptosis of HUVECs for 6 h without any change. Long-term intermittent hypoxia (12 h and 24 h) can increase the apoptosis of HUVECs. 4-PBA can inhibit the apoptosis of HUVECs caused by intermittent hypoxia. Hypoxia (12 h and 24 h) can reduce the content of E NOS produced by endothelial cells, and its effect can be inhibited by 4-PBA. Conclusion Intermittent hypoxia can induce endoplasmic reticulum stress in vascular endothelial cells, induce apoptosis, decrease the level of E NOS and decrease the vasodilator function, and lead to elevated blood pressure.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R766

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