【摘要】：目的 因新生淋巴管在炎癥性角膜病變的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，本研究通過構(gòu)建角膜縫線炎癥模型的方法，誘導(dǎo)小鼠角膜產(chǎn)生新生淋巴管，研究外源性的整合素α9β_1及其特異性抗體Y9A2對(duì)小鼠角膜縫線術(shù)后新生淋巴管的生成及角膜中血管內(nèi)皮生長因子C(Vascular endothelialgrowth factor C，VEGF-C)表達(dá)的影響，并探討其意義。 方法 80只健康雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、縫線對(duì)照組、α9β_1組、α9β_1抑制組，每組20只。正常對(duì)照組不處理；縫線對(duì)照組、α9β_1組、α9β_1抑制組小鼠制作雙眼角膜縫線模型，術(shù)后分別予以左氧氟沙星、左氧氟沙星+α9β_1、左氧氟沙星+α9β_1單抗Y9A2點(diǎn)雙眼，所有藥物均為每日兩次點(diǎn)眼，，連續(xù)14天。術(shù)后每天在手術(shù)顯微鏡下觀察小鼠角膜及縫線的變化和新生血管生長情況。在角膜縫線術(shù)后第3、5、7、14、21天分別隨機(jī)取每組4只小鼠，被處死后取雙眼角膜組織進(jìn)行檢測。其中2只小鼠，左眼角膜進(jìn)行切片后免疫組織化學(xué)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞染色，觀察角膜切片新生淋巴管在不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化并行淋巴管計(jì)數(shù)；右眼角膜進(jìn)行免疫熒光淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞染色觀察全角膜淋巴管的大體形態(tài)。另2只小鼠，左眼角膜用于進(jìn)行RT-PCR檢測VEGF-C mRNA的表達(dá)；右眼角膜組織采用Western blotting法檢測不同時(shí)間點(diǎn)角膜中VEGF-C蛋白的表達(dá)。最后，采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組數(shù)據(jù)資料以mean±S.D.表示，經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差齊，各組測試指標(biāo)的總體均數(shù)比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。 結(jié)果 一、小鼠角膜縫線術(shù)后，角膜的大體變化及新生血管生長情況：手術(shù)顯微鏡下觀察，正常組小鼠角膜透明，角膜緣存在血管網(wǎng)，但角膜中無新生血管�？p線對(duì)照組小鼠角膜縫線模型建立后第3天，角膜緣處可見毛刷狀新生血管發(fā)出；第5天角鞏膜緣處新生血管侵入角膜；第7天角膜新生血管交織成網(wǎng)狀，部分血管已達(dá)縫線處；第14天角膜新生血管超過縫線處并侵入角膜中央，末端呈細(xì)小分枝狀。第21天，垂柳狀侵入并圍繞在縫線周圍。α9β_1組和α9β_1抑制組角膜和縫線對(duì)照組比較，新生血管產(chǎn)生和變化趨勢肉眼下未見明顯差別。 二、免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)：正常對(duì)照組角膜無新生淋巴管；另3組小鼠縫線后有新生淋巴管由角膜緣發(fā)出，在第14天淋巴管計(jì)數(shù)（LVC）達(dá)峰值�？p線對(duì)照組術(shù)后第3天開始出現(xiàn)新生淋巴管，第14天LVC是3.27±0.25；與縫線對(duì)照組比較，在各觀察時(shí)間點(diǎn)時(shí)α9β_1組LVC均增多，第14天LVC4.93±0.38（P0.05），α9β_1抑制組角膜LVC明顯降低，第14天為2.25±0.34（P0.05）。 三、角膜淋巴管免疫熒光染色：正常對(duì)照組在角膜緣內(nèi)可見點(diǎn)狀紅色熒光，角膜內(nèi)無熒光�？p線對(duì)照組、α9β1組、α9β1抑制組在縫線術(shù)后個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)均可見除角膜緣綠色免疫熒光外，自角膜緣發(fā)出的芽狀或管道樣熒光，通過調(diào)節(jié)熒光倒置像差顯微鏡，可發(fā)現(xiàn)這些管樣熒光分布于角膜基質(zhì)的不同層面。 四、RT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果示,正常對(duì)照組僅少量VEGF-C表達(dá)，縫線對(duì)照組VEGF-C表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增多且在第14天達(dá)峰值（P0.05）；與縫線對(duì)照組比較，α9β_1組VEGF-C表達(dá)增高（P0.05），而α9β_1抑制組VEGF-C表達(dá)降低（P0.05）。 結(jié)論 小鼠角膜縫線模型，在誘導(dǎo)角膜產(chǎn)生新生血管的同時(shí)產(chǎn)生新生淋巴管；整合素α9β_1可促進(jìn)角膜新生淋巴管發(fā)生；通過Y9A2抑制整合素α9β_1可下調(diào)VEGF-C的表達(dá)和顯著減少角膜新生淋巴管。
[Abstract]:objective
Because the new lymphatic vessels play an important role in the development of inflammatory keratopathy, this study established a corneal suture inflammation model to induce new lymphatic vessels in the cornea of mice. The expression of C Vascular endothelialgrowth factor C (VEGF-C) was investigated and its significance was discussed.
Method
Eighty healthy female BALB/c mice were randomly divided into normal control group, suture control group, alpha 9 beta 1 group and alpha 9 beta 1 inhibitory group with 20 mice in each group. The changes of cornea and suture and neovascularization in mice were observed under operating microscope every day after operation. Four mice in each group were randomly selected on the 3rd, 5th, 7th, 14th and 21st days after suture surgery. The corneal tissues in both eyes were taken for examination after death. Immunohistochemical staining of lymphatic endothelial cells was performed on the cornea of the left eye and the dynamic changes of lymphatic vessels were observed at different time points. Immunofluorescent staining of lymphatic endothelial cells was performed on the cornea of the right eye to observe the gross morphology of the whole corneal lymphatic vessels. The expression of VEGF-C mRNA was detected by RT-PCR and the expression of VEGF-C protein was detected by Western blotting in right cornea at different time points. One way ANOVA was used. SNK-q test was used to compare 22 of the average in each group.
Result
1. The general changes of cornea and the growth of neovascularization after corneal suture in mice: under the operating microscope, the cornea of normal mice was transparent and there was a vascular network in the corneal limbus, but no new blood vessels were found in the cornea. The corneal neovascularization invaded the cornea at the limbus of cornea and sclera; on the 7th day, the corneal neovascularization interlaced into a network and some of the vessels reached the suture; on the 14th day, the corneal neovascularization exceeded the suture and invaded the central cornea with a small branch at the end. On the 21st day, the willow-shaped invasion and surrounded the suture. Compared with the control group, there was no significant difference in the production and the trend of neovascularization.
2. Immunohistochemistry showed that there was no new lymphatic vessel in the normal control group, and the new lymphatic vessel originated from the limbus of cornea after suture in the other three groups. LVC reached its peak on the 14th day. LVC increased at the time point, LVC4.93 (+0.38) (P 0.05) at the 14th day, and decreased significantly at the 14th day, 2.25 (+0.34) (P 0.05).
Three, corneal lymphatic immunofluorescence staining: normal control group in the limbus of the cornea can see red fluorescence, no fluorescence in the cornea. The tube fluorescence can be found at different levels of the corneal stroma by means of an aberration microscope.
Fourthly, the results of RT-PCR and Western blotting showed that only a small amount of VEGF-C was expressed in the normal control group, and the expression of VEGF-C in the suture control group was significantly increased and peaked at the 14th day (P 0.05); compared with the suture control group, the expression of VEGF-C in the alpha-9 beta-1 group was increased (P 0.05), while that in the alpha-9 beta-1 inhibition group was decreased (P 0.05).
conclusion
The mouse corneal suture model induced corneal neovascularization and lymphangiogenesis; integrin alpha 9 beta 1 promoted corneal neovascularization; Y9A2 inhibited integrin alpha 9 beta 1 down-regulated the expression of VEGF-C and significantly reduced corneal neovascularization.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R779.6

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本文編號(hào)：2182587