【摘要】：感音神經(jīng)性耳聾(sensorineural hearing loss,SNHL)是一種常見的感覺功能障礙性疾病,在耳鼻咽喉科學臨床工作及學習中尤為常見,主要是由內(nèi)耳毛細胞(HCs)及螺旋神經(jīng)元(SGNs)的變性、不可逆損傷所致,可伴隨不同程度的言語功能障礙。鑒于哺乳動物毛細胞的有限再生能力,傳統(tǒng)治療方法如助聽器佩戴、人工耳蝸植入(CI)等無法恢復受損內(nèi)耳的生理功能,但隨著對干細胞的漸進式研究,使得對內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)及毛細胞受損功能的修復成為可能。人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)擁有較為實用的臨床價值,主要是由于其具有增殖分化能力強、低免疫源性、來源廣泛、無致瘤性及倫理道德爭議等優(yōu)點,已開始廣泛應(yīng)用于細胞、組織工程等相關(guān)研究,是較為理想的種子細胞。但干細胞分化的低效率性嚴重阻礙著其發(fā)展。故而,探討一種促使hUC-MSCs更安全、高效的向內(nèi)耳毛細胞樣細胞誘導分化的實驗條件變得尤為關(guān)鍵。Notch信號通路在進化上高度保守、普遍存在于各種生物之中,對內(nèi)耳發(fā)育過程中不同聽覺器官的發(fā)生、發(fā)展來說至關(guān)重要。內(nèi)耳毛細胞的發(fā)育與Notch通路介導的“側(cè)向抑制(lateral inhibition)”機制密不可分。研究發(fā)現(xiàn),(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨�；�-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)通過作用于早老素后抑制γ-分泌酶活性使得Notch蛋白的活化形式NICD產(chǎn)生減少進而調(diào)控下游靶基因表達,削弱Notch通路側(cè)抑制,使毛細胞數(shù)目有所增多。而成年豚鼠的耳毒性試驗發(fā)現(xiàn),當DAPT抑制Notch通路后,可產(chǎn)生異位的聽毛細胞。但DAPT體外調(diào)控hUC-MSCs向內(nèi)耳毛細胞樣細胞分化的研究,目前尚未見報道。目的本研究以γ-分泌酶抑制劑DAPT為切入點,以人來源臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)為對象,探究于體外使用DAPT對hUC-MSCs定向誘導分化為內(nèi)耳毛細胞樣細胞的影響,并探討可能的分子機制,以期提高干細胞向內(nèi)耳毛細胞樣細胞的分化效率,為感音神經(jīng)性聾的治療提供新的理論依據(jù)。方法1、使用實驗室的現(xiàn)有方法,從臍帶中分離出Wharton’s jelly組織后原代培養(yǎng)并獲得hUC-MSCs,進一步操作,采用組織貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)。實驗分為:實驗組(DFNB基礎(chǔ)誘導培養(yǎng)基+EGF+bFGF)、對照組(DFNB基礎(chǔ)誘導培養(yǎng)基)。實驗均在瓊脂糖包被的抗貼壁培養(yǎng)瓶中完成,分化周期為3-5天,促使hUC-MSCs向NSCs方向誘導分化。CCK-8檢測各組細胞的增殖情況,免疫熒光檢測神經(jīng)干細胞標記物Nestin的表達情況,Western Blot、qRT-PCR檢測各組細胞分化中Nestin在蛋白和mRNA水平的表達情況。2、取誘導所得的神經(jīng)干細胞進一步分化,分為DAPT組(DFNB基礎(chǔ)誘導培養(yǎng)基+EGF+ATRA+DAPT)、實驗組(DFNB基礎(chǔ)誘導培養(yǎng)基+EGF+ATRA)及對照組(DFNB基礎(chǔ)誘導培養(yǎng)基)。實驗均在明膠特殊包被的培養(yǎng)瓶中完成,分化周期為2-4周,進一步促使神經(jīng)干細胞向內(nèi)耳毛細胞樣細胞誘導分化。CCK-8檢測各組細胞的增殖情況,免疫熒光檢測毛細胞標記物Math1、MyosinVIIa,Brn3c的表達情況,Western Blot、qRT-PCR檢測各組細胞分化中毛細胞標記物Math1、MyosinVIIa,Brn3c及Hes1、Hes5在蛋白和mRNA水平的表達情況。結(jié)果1、分離、獲取的hUC-MSCs可在體外誘導分化為神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu),與對照組相比,實驗組EGF、bFGF可明顯促進hUC-MSCs的增殖,且神經(jīng)干細胞標記物Nestin的表達明顯增加。2、與對照組相比,經(jīng)2-4周誘導培養(yǎng)基誘導分化后,DAPT組、實驗組均可表達Math1、MyosinVIIa,Brn3c等毛細胞標記物,說明hUC-MSCs誘導為神經(jīng)干細胞后可定向分化為類內(nèi)耳毛細胞樣細胞,同時DAPT組在DAPT作用下Math1、MyosinVIIa,Brn3c的蛋白和mRNA表達水平有所升高,Hes1、Hes5在蛋白和mRNA水平表達顯著降低。結(jié)論1、hUC-MSCs可在體外跨胚層誘導為神經(jīng)干細胞后定向分化為類內(nèi)耳毛細胞樣細胞,可為SNHL提供更為合理、安全的種子細胞。2、DAPT可下調(diào)Notch通路下游基因Hes1、Hes5的表達,促進hUC-MSCs向內(nèi)耳毛細胞樣細胞分化,為干細胞內(nèi)耳移植治療感音神經(jīng)性耳聾提供新的治療思路。
[Abstract]:Sensorineural hearing loss (SNHL) is a common sensory disorder, which is especially common in clinical work and study of otolaryngology. It is mainly caused by the degeneration and irreversible damage of inner ear hair cells (HCs) and spiral neurons (SGNs), and can be accompanied by different degrees of speech dysfunction. The limited regeneration ability of hair cells in dairy animals, traditional treatment methods such as hearing aid wearing, cochlear implantation (CI) can not restore the physiological function of damaged inner ear, but with the gradual study of stem cells, it is possible to repair the spiral ganglion of inner ear and the damaged function of hair cells. Human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) are embracing. Because of its strong ability of proliferation and differentiation, low immunogenicity, extensive sources, non-tumorigenicity and ethical disputes, it has been widely used in cell and tissue engineering research. It is an ideal seed cell. However, the inefficiency of stem cell differentiation seriously hinders its development. Therefore, it is very important to explore a safe and efficient experimental condition for inducing differentiation of hUC-MSCs into inner ear hair cell-like cells. Studies have shown that, (3,5-difluorophenylacetyl) -L-alanyl-L-2-phenylglycine tert-butyl ester (DAPT) reduces the production of NICD, an active form of Notch protein, by inhibiting the activity of gamma-secreting enzymes after acting on presenilin. In adult guinea pigs, when DAPT inhibited Notch pathway, heterotopic auditory hair cells could be produced. However, the study of DAPT regulating the differentiation of hUC-MSCs into inner ear hair cell-like cells in vitro has not been reported. The aim of this study was to investigate the effect of DAPT on the differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) into inner ear hair cell-like cells in vitro, and to explore the possible molecular mechanism in order to improve the differentiation efficiency of stem cells into inner ear hair cell-like cells. Methods 1. Wharton's jelly tissues were isolated from the umbilical cord and cultured in vitro to obtain hUC-MSCs. The hUC-MSCs were isolated and cultured by tissue adherence culture. The experiment was divided into experimental group (DFNB basic induction medium + EGF + bFGF) and control group (DFNB basic induction medium + EGF + bFGF). The experiment was carried out in agarose-coated anti-adherence culture flask. The differentiation cycle was 3-5 days, which promoted the differentiation of hUC-MSCs toward NSCs. CCK-8 was used to detect the proliferation of cells in each group, immunofluorescence was used to detect the expression of neural stem cell marker Nestin, Western Blot and qRT-PCR were used to detect the differentiation of cells in each group. At protein and mRNA levels, neural stem cells were further differentiated into DAPT group (DFNB-based induction medium + EGF + ATRA + DAPT), experimental group (DFNB-based induction medium + EGF + ATRA) and control group (DFNB-based induction medium). The experiment was completed in a special gelatin-coated culture flask with a differentiation cycle of 2-4. CCK-8 was used to detect cell proliferation, immunofluorescence to detect the expression of hair cell markers Math1, MyosinVIIa, Brn3c, Western Blot and qRT-PCR to detect the expression of hair cell markers Math1, MyosinVIIa, Brn3c and Hes1, Hes5 in protein and m. Results 1. The isolated hUC-MSCs could be induced to differentiate into neurosphere-like structures in vitro. Compared with the control group, EGF and bFGF could significantly promote the proliferation of hUC-MSCs, and the expression of neural stem cell marker Nestin was significantly increased. 2. Compared with the control group, the DAPT group was induced to differentiate after 2-4 weeks. All the hair cell markers such as Math1, Myosin VIIa and Brn 3C could be expressed in the test group, indicating that the hair cell-like cells could be differentiated into inner ear hair cell-like cells after induction of neural stem cells by hUC-MSCs. The protein and mRNA expression levels of Math1, Myosin VIIa and Brn 3C were increased in DAPT group, while the protein and mRNA expression levels of Hes 1 and Hes 5 were significantly decreased in DAPT group. HUC-MSCs can differentiate into hair cell-like cells of inner ear after transembryonic induction in vitro, which can provide more reasonable and safe seed cells for SNHL. 2. DAPT can down-regulate the expression of Hes1 and Hes5 genes downstream Notch pathway, promote the differentiation of hUC-MSCs into hair cell-like cells of inner ear, and provide stem cell transplantation for the treatment of sensory nerve. New treatment ideas for deafness.
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R764.43

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