【摘要】：自噬是一種保守的細(xì)胞自我退化的過(guò)程,在細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)鍵時(shí)期如發(fā)育階段或營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)常常對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。然而,有時(shí)自噬也參與細(xì)胞凋亡進(jìn)程。光感受器細(xì)胞是唯一直接暴露在光照下將光刺激轉(zhuǎn)換為視覺(jué)信號(hào)的神經(jīng)元細(xì)胞。但過(guò)強(qiáng)的光照射對(duì)視網(wǎng)膜仍具有細(xì)胞毒性作用。至今為止,視網(wǎng)膜光損傷的確切機(jī)制尚不明確,并且臨床上仍無(wú)有效治療方案,特別是自噬在光誘導(dǎo)感光細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。 1.光照對(duì)誘導(dǎo)661W細(xì)胞產(chǎn)生自噬的作用 目的：通過(guò)不同的自噬檢測(cè)方法,觀察2600Lux可見(jiàn)光照射對(duì)661W細(xì)胞自噬的影響。方法：(1)利用2600Lux可見(jiàn)光處理傳代培養(yǎng)后的661W細(xì)胞株,建立光感受器細(xì)胞光損傷模型。(2)利用WeStesrn blotting檢測(cè)分析自噬標(biāo)志性蛋白LC3在細(xì)胞中的表達(dá)水平,以及利用電子顯微鏡對(duì)自噬體形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行觀察。(3)應(yīng)用3-MA和LY294002兩種不同的自噬抑制劑對(duì)661W細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后,通過(guò)PI染色進(jìn)行細(xì)胞死亡百分比定量評(píng)估,觀察抑制自噬對(duì)661W細(xì)胞光損傷保護(hù)作用的影響。結(jié)果：(1)在光強(qiáng)度26001ux照射1-2d的661W細(xì)胞中LC3II表達(dá)水平明顯增強(qiáng),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中LC3II/LC3I的比例明顯高于對(duì)照組細(xì)胞,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。經(jīng)過(guò)2天光照后,661w細(xì)胞表現(xiàn)出典型的自噬特性,一些胞內(nèi)物質(zhì)如細(xì)胞器被包繞在雙層膜囊內(nèi),成為自噬小體。(2)應(yīng)用10-30μM的LY294002光照前30分鐘對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,細(xì)胞死亡比例從63%下降至20%,其最佳濃度在20μM左右；661W細(xì)胞與2.5-7.5mM的3-MA預(yù)孵化,細(xì)胞死亡率從63%減少至30%,在5mM顯示出最好的保護(hù)作用。其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。結(jié)論：光照是誘導(dǎo)661W細(xì)胞發(fā)生自噬的關(guān)鍵,而且阻斷自噬可以有效地保護(hù)感光細(xì)胞免受損害。 2. MAPK信號(hào)途徑對(duì)光誘導(dǎo)661W細(xì)胞自噬的影響 目的：研究在2600Lux可見(jiàn)光照射條件下,MAPK信號(hào)途徑對(duì)661W細(xì)胞活性的影響,探討自噬在光誘導(dǎo)感光細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。方法：(1)利用2600Lux可見(jiàn)光處理傳代培養(yǎng)后的661W細(xì)胞株,建立光感受器細(xì)胞光損傷模型。(2)利用Western blotting檢測(cè)ERK/磷酸化ERK, JNK/磷酸化JNK, p38/磷酸化p38的表達(dá)水平,通過(guò)PI染色對(duì)ERK抑制劑PD980519, JNK抑制劑SP600125和P38抑制劑SB203580預(yù)處理后的661W細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞死亡百分比定量評(píng)估。(3)在指定時(shí)間內(nèi)收集細(xì)胞裂解,利用Western blotting檢測(cè)ERK和磷酸化ERK后LC3II和LC3I表達(dá)水平的變化,以及通過(guò)LysoTracker染色觀察自噬小體內(nèi)溶酶體生成情況。結(jié)果：(1)收集細(xì)胞裂解,對(duì)ERK/磷酸化ERK, JNK/磷酸化JNK, p38/磷酸化p38的表達(dá)水平進(jìn)行蛋白免疫印跡分析,實(shí)驗(yàn)組(磷酸化組)掃描蛋白條帶光密度測(cè)量強(qiáng)度明顯增加,對(duì)照組(非磷酸化)只略有增加,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。用40-80μM的PD980519對(duì)細(xì)進(jìn)行預(yù)處理,光誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡比例從61%減少至約30%,而SP600125或SB203580對(duì)細(xì)胞免受光損傷的保護(hù)作用效果不顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。(2)通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),用40μPD980519在光照30分鐘前處理細(xì)胞,逆轉(zhuǎn)了P-ERK和ERK的上調(diào)。定量分析結(jié)果表明,在PD980519預(yù)處理組非磷酸化和磷酸化形式的ERK水平均顯著減少。而且光照2天后用40μPD980519處理組降低了LC3II/LC3I比率的上調(diào)。通過(guò)Lyso Tracker染色發(fā)現(xiàn)：用40μMPD980519預(yù)處理即使在光照下也明顯抑制了細(xì)胞溶酶體的形成。差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。結(jié)論：可見(jiàn)光照射可以激活活化蛋白酶(MAPK)通路導(dǎo)致661W細(xì)胞發(fā)生自噬,在激活的MAPK信號(hào)下游通路中,是ERK通路而不是JNK或P-38在光誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡機(jī)制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。通過(guò)阻斷ERK途徑能有效地抑制光誘導(dǎo)的661W細(xì)胞發(fā)生自噬。 本研究的發(fā)現(xiàn)可能在視網(wǎng)膜光損傷的治療中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:Autophagy is a conservative process of self degradation and often protects cells at critical stages of cell growth, such as developmental or nutritional deficiency. However, autophagy sometimes participates in the process of apoptosis. Photoreceptor cells are the only neuron cells that directly expose light stimulation to visual signals under light. Too strong light irradiation still has cytotoxic effects on the retina. Up to now, the exact mechanism of retinal light damage is not clear, and there is still no effective treatment in clinic, especially the mechanism of autophagy in photoreceptor cell apoptosis.
The effect of 1. light on the induction of autophagy in 661W cells
Objective: To observe the effect of 2600Lux visible light irradiation on autophagy of 661W cells by different autophagy methods. Methods: (1) 661W cell lines were treated by 2600Lux visible light treatment, and the photoreceptor cell light damage model was established. (2) the expression of autophagic marker protein LC3 in cell was detected by WeStesrn blotting. 3-MA and LY294002 were used to observe the morphological changes of autophago. (3) after pre treatment of 661W cells with two different autophagic inhibitors, the percentage of cell death was evaluated by PI staining, and the effect of autophagy on the protection of light damage of 661W cells was observed. Results: (1) in light intensity 26 The expression level of LC3II in 661W cells irradiated by 001ux was obviously enhanced. The proportion of LC3II/LC3I in the experimental group was significantly higher than that of the control group. The difference was statistically significant (P0.001). After 2 days of illumination, the 661W cells showed typical autophagy, and some intracellular substances such as the organelles were wrapped around the double layer membrane and became autophagic bodies. (2) the cells were pretreated with 10-30 M LY294002 light before 30 minutes, the proportion of cell death decreased from 63% to 20%, and the optimum concentration was around 20 M; 661W cells incubated with 2.5-7.5mM 3-MA and the cell mortality decreased from 63% to 30%. The difference was statistically significant (P0.001). Conclusion: light (P0.001). Conclusion: light (P0.001). Irradiation is the key to induce autophagy in 661W cells, and blocking autophagy can effectively protect photoreceptors from damage.
Effect of 2. MAPK signaling pathway on autophagy of 661W cells induced by light
Objective: To investigate the effect of MAPK signal pathway on the activity of 661W cells under 2600Lux visible light, and to explore the mechanism of autophagy in photoreceptor cell apoptosis. Methods: (1) using 2600Lux visible light to treat 661W cell lines after subculture, and to establish light damage model of photoreceptor cells. (2) Western blotting detection ERK/ phosphorylated ERK, JNK/ phosphorylated JNK, p38/ phosphorylated p38 expression level. The percentage of cell death of ERK inhibitor PD980519, JNK inhibitor SP600125 and P38 inhibitor pretreatment were evaluated by PI staining. (3) cell lysis was collected at a specified time, and the cells were detected and phosphorylated. The changes in the expression level of LC3II and LC3I after RK, as well as the formation of lysosomes in the small body of autophagy by LysoTracker staining. Results: (1) collect cell lysis, analyze the expression level of ERK/ phosphorylated ERK, JNK/ phosphorylated JNK, p38/ phosphorylated p38, and the test group (phosphorylation group) scanning protein strip light density measurement The strength of the control group (non phosphorylation) was only slightly increased, and the difference was statistically significant (P0.001). The proportion of light induced cell death was reduced from 61% to about 30% with 40-80 M PD980519, while the protective effect of SP600125 or SB203580 on cell protection from light damage was not significant, the difference was statistically significant (P0.001) (2) through Western blot detection, it was found that the up regulation of P-ERK and ERK was reversed with 40 mu PD980519 before light irradiation for 30 minutes. The quantitative analysis showed that the ERK level in the form of non phosphorylation and phosphorylation in the PD980519 preconditioning group decreased significantly. And the up regulation of LC3II/LC3I ratio was reduced by the 40 u PD980519 treatment group after 2 days of light. It was found by Lyso Tracker staining that the formation of lysosomes in cells was obviously inhibited even under light. The difference was statistically significant (P0.001). Conclusion: light irradiation can activate the activation protease (MAPK) pathway to cause 661W cells to occur autophagy, and in the downstream pathway of the activated MAPK signal, it is ERK pass. Roads, not JNK or P-38, play a key role in the mechanism of light induced cell death. By blocking the ERK pathway, autophagy can be effectively inhibited by light induced 661W cells.
The findings of this study may have potential application in the treatment of retinal photodamage.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R774

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本文編號(hào)：2135182