本文選題：SLC26A4 + Pendrin��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：目的： 大前庭水管綜合征(large vestibular aqueduct syndrome, LVAS或enlarged vestibular aqueduct syndrome, EVAS)是以前庭導(dǎo)水管擴大伴有感音神經(jīng)性聾(SNHL)為特征的一種常染色體隱性遺傳性非綜合征型聽力障礙性疾病。目前研究表明,大前庭水管與SLC26A4基因突變有關(guān),是由Everett等在一個常染色體隱性遺傳性疾病--Pendred綜合征的家系中首先發(fā)現(xiàn)的。近年來國外的多項研究表明SLC26A4基因突變與Pendred綜合征和單純前庭水管擴大和或內(nèi)耳畸形有密切的關(guān)系。據(jù)估計,世界范圍內(nèi)兒童語前聾患者中4%～10%由Pendred綜合征導(dǎo)致,我國Pendred綜合征的報道還較少,但前庭水管擴大在耳聾患者中占有相當(dāng)?shù)谋壤LC26A4基因編碼含有780個氨基酸的蛋白質(zhì)Pendrin, Pendrin是一種跨膜蛋白,對S042-、HCO3-、I-、Cl-.甲酸根離子等多種單價或二價離子進行轉(zhuǎn)運,在機體離子成分平衡的維持中發(fā)揮重要作用。因該基因較大(開放閱讀框架2343bp),外顯子多達21個,其突變譜廣,據(jù)報道截至2010年突變多達160種,Pendrin主要表達于甲狀腺,在內(nèi)耳、胎腎和胎腦中也有分布。在內(nèi)耳,Pendrin表達于內(nèi)淋巴管、內(nèi)淋巴囊、橢圓囊、球囊等處。Everett等發(fā)現(xiàn)在胚胎13天,小鼠內(nèi)淋巴管和內(nèi)淋巴囊就有SLC26A4基因mRNA的強表達,淋巴管和內(nèi)淋巴囊與內(nèi)淋巴液代謝有關(guān),內(nèi)淋巴液的酸堿平衡主要由H(+)-ATPase和C1(-)/HCO3(-)維持。Pendrin很可能作為Cl(-)／HCO3(-)轉(zhuǎn)運體調(diào)節(jié)內(nèi)淋巴液的離子平衡,同時作為HCO3(-)轉(zhuǎn)運體將血管紋空間的HCO3(-)分泌入內(nèi)淋巴液,HC03(一)的堆積將限制保護性谷胱甘肽的產(chǎn)生從而增加自由基壓力,HC03(一)的移除有助于保護血管紋免受自由基損傷,維持其正常功能。關(guān)于SLC26A4基因突變引起疾病表型的具體機制目前還沒完全明了。2008年發(fā)表于JMG的一項韓國研究認(rèn)為不同突變通過不同機制導(dǎo)致Pendrin蛋白構(gòu)象和離子轉(zhuǎn)運功能障礙,該研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)突變的異常蛋白產(chǎn)物滯留在細胞內(nèi),而野生型蛋白表達在胞漿膜,從而影響了C1(-)/HC03(-)離子交換功能。此外,突變蛋白也表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性,例如H723R突變蛋白產(chǎn)物主要存在于細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),低溫孵育下這種蛋白產(chǎn)物的異常修飾及受損害的離子轉(zhuǎn)運功能能很大程度的恢復(fù),L236P突變蛋白產(chǎn)物則主要停留在細胞的中心體區(qū),對同樣的溫度治療不敏感。聾病分子流行病學(xué)調(diào)查顯示該基因變異在中國耳聾人群中具有廣泛的異質(zhì)性,其中部分突變在其他人種未見報道。那么,新變異是否能引起確切的疾病表型亟待功能研究證實。本研究擬建立一套SLC26A4基因新變異致病性鑒定系統(tǒng)以分析新發(fā)現(xiàn)變異及其致病性,在蛋白水平探討SLC26A4基因致聾機制,闡釋中國人群特異的SLC26A4基因型表型相關(guān)性,指導(dǎo)臨床SLC26A4相關(guān)耳聾的基因診斷及產(chǎn)前診斷。 方法： 1.克隆野生型SLC26A4,并其構(gòu)建于pEGFP-N1質(zhì)粒上,使其能表達Pendrin融合蛋白 設(shè)計引物擴增SLC26A4基因cDNA序列,將其與pCRⅡ-TA質(zhì)粒連接。隨后將目的基因構(gòu)建于pEGFP-N1質(zhì)粒上,使其能表達Pendrin融合蛋白 2. SLC26A4基因定點誘變,克隆變異型SLC26A4,并其構(gòu)建于pEGFP-N1質(zhì)粒上,使其能表達變異的Pendrin融合蛋白 針對上述最有可能影響Pendrin蛋白功能的10種SLC26A4基因變異分別設(shè)計包含堿基變異位點的一對引物(正、反),應(yīng)用發(fā)展成熟的QuikChange Site-directed Mutagenesis試劑盒進行定點誘變。與模板質(zhì)粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循環(huán)延伸”,正反向引物的延伸產(chǎn)物退火后配對成為帶缺刻的開環(huán)質(zhì)粒。Dpn I酶切延伸產(chǎn)物,由于原來的模板質(zhì)粒來源于常規(guī)的大腸桿菌,是經(jīng)dam甲基化修飾的,Dpn I敏感而被切碎,而體外合成的帶突變序列的質(zhì)粒由于沒有甲基化而不被切開,因此在隨后的轉(zhuǎn)化中得以成功轉(zhuǎn)化,即可得到突變質(zhì)粒的克隆,并突變質(zhì)粒進行測序篩選驗證。 將克隆得到的變異型SLC26A構(gòu)建于pEGFP-N1質(zhì)粒上,使其能表達變異后異常Pendrin融合蛋白 3.將野生型SLC26A4及各種變異型SLC26A4分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞和HeLa細胞 培養(yǎng)HEK293細胞和HeLa細胞,應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑盒,將野生型SLC26A4及各種變異型SLC26A4分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞和HeLa細胞,以分析綠色熒光蛋白(GFP)的熒光信號來鑒定轉(zhuǎn)染效率。 正常的HeLa細胞內(nèi)無Pendrin表達,轉(zhuǎn)染野生型SLC26A4及各種變異型SLC26A4后,可以利用免疫熒光技術(shù)通過激光共聚焦顯徼鏡觀察野生型Pendrin及各種異常型Pendrin在HeLa細胞內(nèi)的定位。在HEK293細胞細胞內(nèi)觀察野生型Pendrin及各種異常型Pendrin對甲酸根離子轉(zhuǎn)運能力。 4.用同位素標(biāo)記法測量細胞內(nèi)的甲酸根離子。 結(jié)果： 1.構(gòu)建的野生型質(zhì)粒pEGFP-SLC26A4經(jīng)測序后,與NCBI的GenBank上發(fā)布的NM000441.1比較序列完全一致。 2.野生型pEGFP-SLC26A4質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染細胞表達Pendrin融合蛋白后,Western Blot檢測出87kDa(?)小的蛋白。 3.通過將各種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后發(fā)現(xiàn),野生(?)SLC26A4基因表達產(chǎn)物Pendrin表達于細胞膜上,各突變型SLC26A4基因表達產(chǎn)物Pendrin有的表達于細胞膜上,有的表達于細胞質(zhì)內(nèi),有的在細胞膜和細胞質(zhì)內(nèi)均有表達。 4.通過同位素標(biāo)記法測量出各種轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)的甲酸根離子,實驗顯示突變基因表達的Pendrin蛋白對于甲酸根離子的轉(zhuǎn)運效率發(fā)生了不同程度的下降。 結(jié)論： 1.本研究的突變型SLC26A4表達產(chǎn)物Pendrin蛋白在細胞內(nèi)的定位發(fā)生改變,有的表達于細胞膜上,有的表達于細胞質(zhì)內(nèi),有的在細胞膜和細胞質(zhì)內(nèi)均有表達,這也是其轉(zhuǎn)運功能發(fā)生改變的基礎(chǔ)。 2.本研究的10種突變型SLC26A4表達產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運功能均有不同程度的下降,即使有的突變型SLC26A4表達產(chǎn)物Pendrin蛋白表達于細胞膜上,其編碼的Pendrin蛋白無法完成正常的陰離子交換功能,對甲酸根離子的轉(zhuǎn)運功能有不同程度的下降,從而導(dǎo)致耳聾的發(fā)生。
[Abstract]:Purpose :

In recent years , it is estimated that the SLC26A4 gene mutation is related to SLC26A4 gene mutation . In this study , a set of SLC26A4 gene mutation pathogenic identification system is proposed to analyze the mutation and pathogenicity of SLC26A4 gene . The SLC26A4 gene - induced deafness in Chinese population is analyzed , and the gene diagnosis and prenatal diagnosis of SLC26A4 related deafness are explained .

Method :

1 . The wild - type SLC26A4 was cloned , and it was constructed on the eukaryotic expression of the fusion protein of Pendrin .

The cDNA sequence of SLC26A4 gene was amplified by designing primer and ligated with pCR 鈪，

本文編號：2070297