本文選題：視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞 + 凋亡　； 參考：《遵義醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：目的:探討藍(lán)光誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial cells,RPE)細(xì)胞凋亡過程中,胞內(nèi)鈣離子(Ca~(2+))在Ca~(2+)-PKC信號傳導(dǎo)通路及與線粒體損傷的凋亡途徑的相關(guān)作用機制。方法:原代培養(yǎng)健康人RPE細(xì)胞,傳至第3-6代用于本實驗。采用藍(lán)光(470nm-490nm),光照強度為(2,000±500)lx,經(jīng)藍(lán)光照射時間6h后,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24h,建立藍(lán)光損傷人RPE細(xì)胞模型。采用免疫組化(IHC)染色光學(xué)顯微鏡下鑒定凋亡細(xì)胞,通過透射電鏡(TEM)觀察RPE的核型變和線粒體形態(tài)學(xué)改變。將體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞隨機分成4組:1A組:無光照組;1B組:光照組;1C組:光照+硝苯地平(Nifedipine)組;1D組:光照+(-)Bay K8644組。采用RT-PCR技術(shù)測定細(xì)胞膜L-型鈣通道(L-type calcium channel)α1C、α1D、α1F亞型的m RNA表達(dá)量。將體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞隨機分成5組:2A組:無光照組;2B組:光照組;2C組:光照+硝苯地平組;2D組:光照+鈣磷酸結(jié)合蛋白(Calphostin C)組;2E組:光照+佛波酯(PMA)組。激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)用于檢測各組RPE細(xì)胞內(nèi)游離Ca~(2+)濃度,分析熒光強度。采用非放射性核素法檢測RPE胞內(nèi)PKC活性。采用Western blot法測定各組RPE胞內(nèi)Caspase-9蛋白的表達(dá)。將體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞隨機分為3組,3A組:(500±100)lx、(2,000±500)lx、(3,000±500)lx光照強度,光照時間6h,光照后細(xì)胞終止培養(yǎng)時間24h;3B組:(2,000±500)lx光照強度,光照時間3h、6h、12h、24h,,光照后細(xì)胞終止培養(yǎng)時間24h;3C組:(2,000±500)lx光照強度,光照時間6h,光照后細(xì)胞終止培養(yǎng)時間6h、12h、24h、36h和48h;對照組:無光照組,流式細(xì)胞術(shù)用于檢測細(xì)胞線粒體跨膜電位(ΔψM)。將體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞隨機分為2組:4A組:光照強度(2,000±500)lx,光照時間6h,光照后細(xì)胞終止培養(yǎng)時間6、12、24、36h;4B組:光照強度(2,000±500)lx,光照時間12h,光照后細(xì)胞終止培養(yǎng)時間6h、12h、24h和36h,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定細(xì)胞色素C(Cyt C)濃度。將體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞分成2組:5A組:無光照組;5B組:單純光照組,Western blot法測定Bax、Bcl-2、Bcl-xl蛋白表達(dá)量。采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果:體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞在藍(lán)光(470-490nm),光照強度(2000±500)lx,光照時間6h,光照后細(xì)胞終止培養(yǎng)時間24h后出現(xiàn)細(xì)胞凋亡,IHC染色表現(xiàn)為細(xì)胞核濃縮、染色質(zhì)邊聚成新月形、細(xì)胞核碎裂成數(shù)個;透射電子顯微鏡下觀察可見線粒體膜破碎,嵴完全消失,染色質(zhì)聚核膜邊并濃集,呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡核型變。RT-PCR測定L-型膜型鈣通道的α1C、α1D、α1F亞基m RNA表達(dá)量比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=45.92,P0.05;F=50.32,P0.05;F=18.50,P0.05)。LSCM檢測RPE細(xì)胞內(nèi)游離Ca~(2+)濃度結(jié)果顯示,光照組(2E組2B組2D組2C組,P0.05)均高于無光照組(2A組),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=26764.22,P0.05)。非放射性核素法檢測RPE細(xì)胞內(nèi)PKC活性結(jié)果顯示,光照組(2B組)IA值明顯高于對照組(2A組)IA值(t=-9.869,P0.05)。胞內(nèi)Ca~(2+)濃度與PKC活性通過線性回歸分析顯示:胞內(nèi)Ca~(2+)與PKC呈正相關(guān)關(guān)系(Y=53.032X+127.565,其中:r=0.990,t=13.931,P0.05)。Western blot法測定各組RPE細(xì)胞內(nèi)caspase-9蛋白相對表達(dá)量顯示,2B、2D、2E組與2A組比較,caspase-9蛋白相對表達(dá)量均明顯升高(P0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞線粒體膜電位(ΔψM)顯示:3A組隨著光照強度增加,RPE線粒體膜電位(ΔψM)開始下降(P0.05);3B組中光照6h、12h組與對照組比較,RPE線粒體膜電位(ΔψM)明顯下降(P0.05);3C組中的光照6h、12h、24h、36h、48h與對照組比較,RPE線粒體膜電位(ΔψM)明顯下降(P0.05)。ELISA法測定Cyt C結(jié)果顯示:4A組:光照6h處理繼續(xù)培養(yǎng)的24h、36h組與對照組、6h、12h組比較,Cyt C濃度明顯增加(P0.05)。4B組:光照12h處理繼續(xù)培養(yǎng)12h、24h、36h組與對照組比較,Cyt C濃度明顯增加(P0.05)。Western blot法測定Bax、Bcl-2、Bcl-xl蛋白表達(dá)量,結(jié)果顯示:光照組(5B組)RPE細(xì)胞與無光照組(5A組)比較,Bax表達(dá)量增加,而Bcl-2、Bcl-xl表達(dá)量下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且Bax/Bcl-2值、Bax/Bcl-xl值與無光照組比較,明顯高于無光照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:藍(lán)光可誘導(dǎo)人RPE細(xì)胞凋亡,出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡核型變和胞內(nèi)線粒體損傷。藍(lán)光照射后可引起RPE細(xì)胞膜L-型鈣通道α1C、α1D、α1F亞基的m RNA表達(dá)增高,細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)熒光強度及PKC活性不同程度增強,且胞內(nèi)Ca~(2+)濃度及PKC活性呈正相關(guān)關(guān)系。與此同時,藍(lán)光照射后RPE細(xì)胞線粒體膜電位(ΔψM)明顯下降,Cyt C大量釋放,促凋亡因子Bax與抑凋亡因子Bcl-2、Bcl-xl比值下調(diào),觸發(fā)caspase-9蛋白相對表達(dá)量增加,最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。鈣離子同時參與Ca~(2+)-PKC信號傳導(dǎo)通路促凋亡過程及細(xì)胞線粒體凋亡途徑,并起著啟動、調(diào)控、促進細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵作用。
[Abstract]:Objective: To investigate the mechanism of intracellular calcium (Ca~ (2+)) in Ca~ (2+) -PKC signal transduction pathway and the apoptosis pathway of mitochondrial damage during apoptosis of retinal pigment epithelial cells (RPE) cells. Methods: primary culture of healthy human RPE cells was used for the 3-6 generation to be used in this experiment. Blue light (470nm-490nm), light intensity (2000 + 500) LX, after blue light irradiation time 6h, continue to culture 24h, establish a human RPE cell model with blue light damage. The apoptotic cells were identified by immunohistochemical (IHC) staining optical microscope, and the morphological changes of RPE and mitochondrial morphology were observed by transmission electron microscopy (TEM). The human RPE was cultured in vitro. The cells were randomly divided into 4 groups: group 1A: no light group; group 1B: light group; group 1C: Light + nifedipine (Nifedipine) group; 1D group: Light + (-) Bay K8644 group. RT-PCR technique was used to determine the L- type calcium channel of cell membrane (L-type calcium channel). Group 2B: light group; group 2C: Light + nifedipine group; group 2D: Light + calcium phosphate binding protein (Calphostin C) group; 2E group: Light + phorbol ester (PMA) group. Laser scanning confocal microscopy (LSCM) was used to detect the concentration of free Ca~ (2+) in RPE cells in each group and analyze the fluorescence intensity. Ern blot method was used to determine the expression of Caspase-9 protein in RPE cells. The RPE cells in vitro were randomly divided into 3 groups, 3A group: (500 + 100) LX, (2000 + 500) LX, (3000 + 500) LX light intensity, light time 6h, and cell termination culture time 24h, 3B group: (2000 + 500) light intensity, illumination time, lighting time, cell termination Culture time 24h; group 3C: (2000 + 500) LX light intensity, light time 6h, cell termination culture time after light 6h, 12h, 24h, 36h and 48h; control group: no light group, flow cytometry was used to detect cell mitochondrial transmembrane potential (delta M). The cultured human RPE cells were randomly divided into 2 groups: 4A group: illumination intensity (2000 + 500), illumination time, Cell terminating culture time after light was 6,12,24,36h; 4B group: light intensity (2000 + 500) LX, light time 12h, cell termination culture time 6h, 12h, 24h and 36h, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) determination of cytochrome C (Cyt C) concentration. The cultured human cells were divided into 2 groups: no light group; simple light group Lot method was used to determine the expression of Bax, Bcl-2, Bcl-xl protein. The experimental data were statistically analyzed by SPSS 20 statistical software. Results: the human RPE cells in vitro were in blue light (470-490nm), light intensity (2000 + 500) LX, light time 6h, cell apoptosis after the cell termination culture time 24h, IHC staining showed nuclear concentration, The chromatin was clustered into crescent shaped crescent shape, and the nucleus fragmentation was several. Under transmission electron microscope, the mitochondrial membrane breakage was observed, the crista completely disappeared, the chromatin polynuclear membrane edge was concentrated, and the expression of alpha 1C, alpha 1D, and alpha 1F subunit m RNA in a typical apoptotic karyotype change was statistically significant (F=4) (F=4). 5.92, P0.05, F=50.32, P0.05, F=18.50, P0.05).LSCM detection of intracellular free Ca~ (2+) concentration in RPE cells showed that the light group (2E group 2B group 2D group) was higher than the non light group, and the difference was statistically significant. The IA value of the control group (group 2A) (t=-9.869, P0.05). The intracellular Ca~ (2+) concentration and PKC activity by linear regression analysis showed that the intracellular Ca~ (2+) was positively correlated with PKC. The relative expression of -9 protein increased significantly (P0.05). The cell mitochondrial membrane potential (delta M) detected by flow cytometry showed that the mitochondrial membrane potential (delta M) of RPE began to decrease with the increase of light intensity (P0.05) in the 3A group, and 6h in 3B group, and the RPE mitochondrial membrane potential (delta M) decreased significantly in the 3B group, and the RPE mitochondrial membrane potential (delta M) was significantly decreased. 24 H, 36h, 48h compared with the control group, RPE mitochondrial membrane potential (P0.05) significantly decreased (P0.05).ELISA method for the determination of Cyt C results showed: 4A group: 6h treatment of 24h, compared with the control group. The expression of Bax, Bcl-2, Bcl-xl protein was measured with the addition of (P0.05).Western blot. The results showed that the expression of RPE cells in the light group (5B group) was higher than that in the non light group (5A group), and the expression of Bax increased, while Bcl-2, the Bcl-xl expression decreased, and the difference was significantly higher than that in the non light group, and the difference was significantly higher than that in the non light group. Statistical significance (P0.05). Conclusion: blue light can induce apoptosis of human RPE cells, and there are typical apoptotic karyotype changes and intracellular mitochondrial damage. Blue light irradiation can cause the L- calcium channel alpha 1C, alpha 1D, the m RNA expression of the alpha 1F subunit in the RPE cell membrane, the enhancement of the Ca~ (2+) fluorescence intensity and the PKC activity in the cell, and the intracellular relaxation. At the same time, there was a positive correlation between the concentration and PKC activity. At the same time, the mitochondrial membrane potential (delta M) of RPE cells decreased significantly, Cyt C was released, the apoptosis factor Bax and the anti apoptotic factor Bcl-2, Bcl-xl ratio down regulated, triggered the increase of the relative expression of caspase-9 protein, and the ultimate induction of apoptosis. Calcium ions participated in Ca~ (2+) -PKC signal at the same time. Conduction pathway promotes apoptosis and cell mitochondria apoptosis pathway, and plays a key role in initiating, regulating and promoting cell apoptosis.
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R774

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本文編號：2033143