本文選題：鼻咽癌 + 順鉑　； 參考：《蚌埠醫(yī)學(xué)院》2012年碩士論文

【摘要】：目的： 1.觀察順鉑（cisplatin，DDP）或電離輻射（ionizing radiation，IR）對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，以及DDP、IR能否誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬。 2.觀察自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用，以及對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞放化療的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。 3.觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）、衣霉素（tunicamycin，TM）對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞增殖抑制的影響，以及自噬抑制劑3-MA對(duì)2-DG、TM誘導(dǎo)的人鼻咽癌細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。 方法： 1. MTT法檢測(cè)DDP（0.06、0.60、6.00、60.0、600μmol·L~(-1)）、IR（2、4、6、8、10Gy）處理人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-224、36、48h后對(duì)細(xì)胞存活率的影響；Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DDP（6.00μmol·L~(-1)）、IR（4Gy）對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用；Western blotting法檢測(cè)DDP（6.00μmol·L~(-1)）、IR（4Gy）處理人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-26、16、24h后對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、自噬相關(guān)蛋白beclin1和LC3表達(dá)的影響。 2. MTT法檢測(cè)自噬抑制劑3-MA（0.625、1.25、2.5、5、10mmol·L~(-1)）對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2存活率的影響；采用MTT法和集落克隆形成法檢測(cè)了自噬抑制劑3-MA對(duì)DDP、IR刺激人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用的影響；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)、DAPI染色熒光顯微鏡觀察自噬抑制劑3-MA（1mmol·L~(-1)）對(duì)DDP（6.00μmol·L~(-1)）、IR（4Gy）誘導(dǎo)的人鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響；同上處理，Western blotting法檢測(cè)自噬抑制劑3-MA對(duì)DDP、IR誘導(dǎo)的人鼻咽癌細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白beclin1和LC3表達(dá)的影響；Immunocytochemistry法檢測(cè)自噬抑制劑3-MA對(duì)DDP、IR誘導(dǎo)的人鼻咽癌細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白beclin1表達(dá)的影響。 3. MTT法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑2-DG（1.25、2.5、5、10、20mmol·L~(-1)）、TM（2、 4、8、16、32μmol·L~(-1)）對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2存活率的影響；采用MTT法和集落克隆形成法檢測(cè)了自噬抑制劑3-MA對(duì)2-DG、TM刺激人鼻咽癌細(xì)胞增殖抑制作用的影響；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)、DAPI染色熒光顯微鏡檢測(cè)自噬抑制劑3-MA對(duì)2-DG（5mmol·L~(-1)）、TM（1μmol·L~(-1)）誘導(dǎo)的人鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響；同上處理，Western blotting法檢測(cè)自噬抑制劑3-MA對(duì)2-DG、TM刺激的人鼻咽癌細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白beclin1和LC3表達(dá)的影響；Immunocytochemistry法熒光顯微鏡檢測(cè)自噬抑制劑3-MA對(duì)2-DG、TM誘導(dǎo)的人鼻咽癌細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白beclin1表達(dá)的影響。 結(jié)果： 一、DDP、IR對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2增殖及凋亡的影響 1．MTT法結(jié)果顯示不同濃度的DDP、不同劑量的IR對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2均具有增殖抑制作用，且隨著DDP濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，DDP對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用增強(qiáng)，6.00μmol·L~(-1)DDP作用于人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2的24、36、48h存活率分別為80.74%、79.95%、78.92%和82.15%、82.05%、79.13%；隨著IR劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，IR對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用也逐漸增強(qiáng)，4Gy IR作用于人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-224、36、48h后細(xì)胞存活率分別為82.29%、73.51%、62.35%和92.35%、83.58%、72.37%。 2．6.00μmol·L~(-1)DDP刺激人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-224h后，誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2的凋亡率分別為5.8%和6.7%，與陰性對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，4Gy IR作用24h誘導(dǎo)的人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2的凋亡率分別為5.1%和5.4%，與陰性對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3．經(jīng)6.00μmol·L~(-1) DDP、4Gy IR處理人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-26、16、24h后，人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志蛋白GRP78呈時(shí)間依賴性上調(diào)，自6h起逐漸升高，24h達(dá)到高峰。Western blotting法進(jìn)一步檢測(cè)了放化療后自噬的標(biāo)志蛋白beclin1、LC3的變化，結(jié)果顯示放化療后人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2自噬標(biāo)志蛋白beclin1呈時(shí)間依賴性上調(diào)，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化。 二、3-MA聯(lián)合DDP、IR對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡和自噬相關(guān)蛋白beclin1、LC3表達(dá)的影響 1．MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示：CNE-1、CNE-2細(xì)胞經(jīng)不同濃度3-MA處理后，出現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制作用，并且隨著3-MA濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，3-MA對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增加。在3-MA作用于人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2的劑量中，0.625mmol·L~(-1)無(wú)明顯細(xì)胞死亡，為非抑制濃度。 6.00μmol·L~(-1)DDP、4Gy IR、1mmol·L~(-1)3-MA以及合用組作用不同時(shí)間（24、36、48h）對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2具有增殖抑制作用。結(jié)果顯示，DDP、IR與3-MA合用組人鼻咽癌細(xì)胞存活率明顯降低，均低于單用組，與陰性對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 使用0.1mmol·L~(-1)3-MA和（或）0.60μmol·L~(-1)DDP、0.4Gy IR刺激細(xì)胞，集落克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)DDP、IR對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用的影響。結(jié)果表明：DDP、IR、3-MA在低劑量（或濃度）時(shí)即可明顯抑制CNE-1、CNE-2細(xì)胞的集落克隆形成，3-MA可增強(qiáng)DDP、IR的抑制作用。 2．實(shí)驗(yàn)中采用6.00μmol·L~(-1)DDP、4Gy IR、1mmol·L~(-1)3-MA以及合用組處理人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-224h，，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）檢測(cè)結(jié)果顯示：陽(yáng)性對(duì)照藥CCCP（50μmol·L~(-1)）處理細(xì)胞20min，與陰性對(duì)照組比較細(xì)胞的紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變比較明顯，單用組沒有觀察到紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變，合用組紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變也比較明顯；DAPI染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化，合用組人鼻咽癌CNE-1、CNE-2細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核皺縮濃集而呈亮藍(lán)色熒光，或核呈分葉，碎片狀；而在陰性對(duì)照組中及單獨(dú)處理組中未發(fā)現(xiàn)異常形態(tài)的細(xì)胞核表現(xiàn)，可見細(xì)胞核輪廓清晰圓滑，發(fā)出淡藍(lán)色熒光，結(jié)構(gòu)均一。 3．Western blotting法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白beclin1、LC3的變化，結(jié)果顯示：陰性對(duì)照組人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2中，自噬反應(yīng)處于較低水平，自噬相關(guān)蛋白beclin1表達(dá)較多，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化；而經(jīng)過DDP或IR處理組出現(xiàn)較強(qiáng)的自噬反應(yīng)，自噬相關(guān)蛋白beclin1較對(duì)照組高，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化明顯減少。3-MA與DDP、IR聯(lián)合處理組自噬相關(guān)蛋白beclin1表達(dá)明顯降低，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化與DDP、IR組比較明顯減少。Immunocytochemistry法進(jìn)一步觀察了自噬相關(guān)蛋白beclin1表達(dá)，與Westernblotting結(jié)果一致。 三、3-MA聯(lián)合2-DG、TM對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡和自噬相關(guān)蛋白beclin1、LC3表達(dá)的影響 1．MTT法結(jié)果顯示隨著2-DG濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，2-DG對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用增強(qiáng)，5mmol·L~(-1)2-DG作用于人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2后24、36、48h存活率分別為72.13%、53.14%、47.99%和69.32%、68.02%、67.02%。2μmol·L~(-1)TM作用于人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2的24、48、72h存活率分別為72.43%、69.05%、65.13%和93.28%、91.58%、79.21%。 MTT法檢測(cè)了5mmol·L~(-1)2-DG、1μmol·L~(-1)TM、1mmol·L~(-1)3-MA以及2-DG、TM與3-MA合用組作用不同時(shí)間（24、36、48h）對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2的增殖抑制作用。結(jié)果顯示，2-DG、TM與3-MA合用組人鼻咽癌細(xì)胞存活率明顯降低，均低于單用組，與陰性對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 0.1mmol·L~(-1)3-MA和（或）0.5mmol·L~(-1)2-DG、0.1μmol·L~(-1)TM刺激細(xì)胞，采用集落克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用的影響。結(jié)果表明：2-DG、TM在低濃度即可明顯抑制CNE-1、CNE-2細(xì)胞的集落克隆形成，3-MA增強(qiáng)2-DG、TM的抑制作用。 2．5mmol·L~(-1)2-DG、1μmol·L~(-1)TM、1mmol·L~(-1)3-MA以及合用組處理人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-224h，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）檢測(cè)結(jié)果顯示：陽(yáng)性對(duì)照藥CCCP（50μmol·L~(-1)）處理細(xì)胞20min，與陰性對(duì)照組比較細(xì)胞的紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變比較明顯，單用組沒有觀察到紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變，合用組紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變也比較明顯；DAPI染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化，合用組人鼻咽癌CNE-1、CNE-2細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核皺縮濃集而呈亮藍(lán)色熒光，或核呈分葉，碎片狀；而在陰性對(duì)照組中及單獨(dú)處理組中未發(fā)現(xiàn)異常形態(tài)的細(xì)胞核表現(xiàn)，可見細(xì)胞核輪廓清晰圓滑，發(fā)出淡藍(lán)色熒光，結(jié)構(gòu)均一。 3．Western blotting法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白beclin1、LC3的變化，結(jié)果顯示：陰性對(duì)照組人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2中，自噬反應(yīng)處于較低水平，自噬相關(guān)蛋白beclin1表達(dá)較多，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化；而經(jīng)過2-DG或TM處理組出現(xiàn)較強(qiáng)的自噬反應(yīng)，自噬相關(guān)蛋白beclin1較對(duì)照組高，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化明顯減少。3-MA與2-DG、TM聯(lián)合處理組自噬相關(guān)蛋白beclin1表達(dá)明顯降低，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化與2-DG、TM組比較明顯減少。Immunocytochemistry法進(jìn)一步觀察了自噬相關(guān)蛋白的beclin1表達(dá)，與Westernblotting結(jié)果一致。 結(jié)論： 1. DDP、IR對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2具有增殖抑制作用，且隨著劑量（或濃度）的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸降低，但細(xì)胞對(duì)DDP、IR誘導(dǎo)的凋亡不敏感。作用機(jī)制可能與DDP、IR誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所誘發(fā)的自噬的保護(hù)作用相關(guān)。 2.自噬抑制劑3-MA對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2具有增殖抑制作用，且隨著劑量（或濃度）的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸降低。3-MA增強(qiáng)DDP、IR對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用。作用機(jī)制可能與自噬抑制劑抑制細(xì)胞產(chǎn)生自噬相關(guān)。 3.自噬抑制劑3-MA增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑2-DG、TM對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的自噬。進(jìn)一步表明了人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2對(duì)DDP、IR的不敏感性可能來(lái)自于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬所產(chǎn)生的保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.63

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本文編號(hào)：2029137