發(fā)布時間：2018-06-17 02:10

  本文選題：鼻咽癌 + 順鉑��； 參考：《蚌埠醫(yī)學院》2012年碩士論文

【摘要】：目的： 1.觀察順鉑（cisplatin，DDP）或電離輻射（ionizing radiation，IR）對人鼻咽癌細胞增殖抑制及誘導凋亡作用，以及DDP、IR能否誘導人鼻咽癌細胞產生內質網應激、自噬。 2.觀察自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）對人鼻咽癌細胞增殖抑制及誘導凋亡的作用，以及對人鼻咽癌細胞放化療的增殖抑制及誘導凋亡作用和自噬相關蛋白表達的影響。 3.觀察內質網應激誘導劑2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）、衣霉素（tunicamycin，TM）對人鼻咽癌細胞增殖抑制的影響，以及自噬抑制劑3-MA對2-DG、TM誘導的人鼻咽癌細胞凋亡及自噬相關蛋白表達的影響。 方法： 1. MTT法檢測DDP（0.06、0.60、6.00、60.0、600μmol·L~(-1)）、IR（2、4、6、8、10Gy）處理人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-224、36、48h后對細胞存活率的影響；Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測DDP（6.00μmol·L~(-1)）、IR（4Gy）對人鼻咽癌細胞誘導凋亡的作用；Western blotting法檢測DDP（6.00μmol·L~(-1)）、IR（4Gy）處理人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-26、16、24h后對人鼻咽癌細胞中內質網應激相關蛋白GRP78、自噬相關蛋白beclin1和LC3表達的影響。 2. MTT法檢測自噬抑制劑3-MA（0.625、1.25、2.5、5、10mmol·L~(-1)）對人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2存活率的影響；采用MTT法和集落克隆形成法檢測了自噬抑制劑3-MA對DDP、IR刺激人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用的影響；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、DAPI染色熒光顯微鏡觀察自噬抑制劑3-MA（1mmol·L~(-1)）對DDP（6.00μmol·L~(-1)）、IR（4Gy）誘導的人鼻咽癌細胞凋亡的影響；同上處理，Western blotting法檢測自噬抑制劑3-MA對DDP、IR誘導的人鼻咽癌細胞中自噬相關蛋白beclin1和LC3表達的影響；Immunocytochemistry法檢測自噬抑制劑3-MA對DDP、IR誘導的人鼻咽癌細胞中自噬相關蛋白beclin1表達的影響。 3. MTT法檢測內質網應激誘導劑2-DG（1.25、2.5、5、10、20mmol·L~(-1)）、TM（2、 4、8、16、32μmol·L~(-1)）對人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2存活率的影響；采用MTT法和集落克隆形成法檢測了自噬抑制劑3-MA對2-DG、TM刺激人鼻咽癌細胞增殖抑制作用的影響；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、DAPI染色熒光顯微鏡檢測自噬抑制劑3-MA對2-DG（5mmol·L~(-1)）、TM（1μmol·L~(-1)）誘導的人鼻咽癌細胞凋亡的影響；同上處理，Western blotting法檢測自噬抑制劑3-MA對2-DG、TM刺激的人鼻咽癌細胞中自噬相關蛋白beclin1和LC3表達的影響；Immunocytochemistry法熒光顯微鏡檢測自噬抑制劑3-MA對2-DG、TM誘導的人鼻咽癌細胞中自噬相關蛋白beclin1表達的影響。 結果： 一、DDP、IR對人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2增殖及凋亡的影響 1．MTT法結果顯示不同濃度的DDP、不同劑量的IR對人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2均具有增殖抑制作用，且隨著DDP濃度的增加和作用時間的延長，DDP對人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用增強，6.00μmol·L~(-1)DDP作用于人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2的24、36、48h存活率分別為80.74%、79.95%、78.92%和82.15%、82.05%、79.13%；隨著IR劑量的增加和作用時間的延長，IR對人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用也逐漸增強，4Gy IR作用于人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-224、36、48h后細胞存活率分別為82.29%、73.51%、62.35%和92.35%、83.58%、72.37%。 2．6.00μmol·L~(-1)DDP刺激人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-224h后，誘導人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2的凋亡率分別為5.8%和6.7%，與陰性對照組比較無統(tǒng)計學意義，4Gy IR作用24h誘導的人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2的凋亡率分別為5.1%和5.4%，與陰性對照組比較無統(tǒng)計學意義。 3．經6.00μmol·L~(-1) DDP、4Gy IR處理人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-26、16、24h后，人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2內質網應激反應的標志蛋白GRP78呈時間依賴性上調，自6h起逐漸升高，24h達到高峰。Western blotting法進一步檢測了放化療后自噬的標志蛋白beclin1、LC3的變化，結果顯示放化療后人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2自噬標志蛋白beclin1呈時間依賴性上調，自噬相關蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉化。 二、3-MA聯(lián)合DDP、IR對人鼻咽癌細胞增殖抑制及誘導凋亡和自噬相關蛋白beclin1、LC3表達的影響 1．MTT法檢測結果顯示：CNE-1、CNE-2細胞經不同濃度3-MA處理后，出現(xiàn)細胞增殖抑制作用，并且隨著3-MA濃度的增加和作用時間的延長，3-MA對細胞的增殖抑制作用逐漸增加。在3-MA作用于人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2的劑量中，0.625mmol·L~(-1)無明顯細胞死亡，為非抑制濃度。 6.00μmol·L~(-1)DDP、4Gy IR、1mmol·L~(-1)3-MA以及合用組作用不同時間（24、36、48h）對人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2具有增殖抑制作用。結果顯示，DDP、IR與3-MA合用組人鼻咽癌細胞存活率明顯降低，均低于單用組，與陰性對照組比較均有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 使用0.1mmol·L~(-1)3-MA和（或）0.60μmol·L~(-1)DDP、0.4Gy IR刺激細胞，集落克隆形成實驗進一步檢測DDP、IR對人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用的影響。結果表明：DDP、IR、3-MA在低劑量（或濃度）時即可明顯抑制CNE-1、CNE-2細胞的集落克隆形成，3-MA可增強DDP、IR的抑制作用。 2．實驗中采用6.00μmol·L~(-1)DDP、4Gy IR、1mmol·L~(-1)3-MA以及合用組處理人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-224h，，線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）檢測結果顯示：陽性對照藥CCCP（50μmol·L~(-1)）處理細胞20min，與陰性對照組比較細胞的紅色熒光向綠色熒光轉變比較明顯，單用組沒有觀察到紅色熒光向綠色熒光轉變，合用組紅色熒光向綠色熒光轉變也比較明顯；DAPI染色熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)學的變化，合用組人鼻咽癌CNE-1、CNE-2細胞表現(xiàn)為細胞核皺縮濃集而呈亮藍色熒光，或核呈分葉，碎片狀；而在陰性對照組中及單獨處理組中未發(fā)現(xiàn)異常形態(tài)的細胞核表現(xiàn)，可見細胞核輪廓清晰圓滑，發(fā)出淡藍色熒光，結構均一。 3．Western blotting法檢測自噬相關蛋白beclin1、LC3的變化，結果顯示：陰性對照組人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2中，自噬反應處于較低水平，自噬相關蛋白beclin1表達較多，自噬相關蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉化；而經過DDP或IR處理組出現(xiàn)較強的自噬反應，自噬相關蛋白beclin1較對照組高，自噬相關蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉化明顯減少。3-MA與DDP、IR聯(lián)合處理組自噬相關蛋白beclin1表達明顯降低，自噬相關蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉化與DDP、IR組比較明顯減少。Immunocytochemistry法進一步觀察了自噬相關蛋白beclin1表達，與Westernblotting結果一致。 三、3-MA聯(lián)合2-DG、TM對人鼻咽癌細胞增殖抑制及誘導凋亡和自噬相關蛋白beclin1、LC3表達的影響 1．MTT法結果顯示隨著2-DG濃度的增加和作用時間的延長，2-DG對人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用增強，5mmol·L~(-1)2-DG作用于人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2后24、36、48h存活率分別為72.13%、53.14%、47.99%和69.32%、68.02%、67.02%。2μmol·L~(-1)TM作用于人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2的24、48、72h存活率分別為72.43%、69.05%、65.13%和93.28%、91.58%、79.21%。 MTT法檢測了5mmol·L~(-1)2-DG、1μmol·L~(-1)TM、1mmol·L~(-1)3-MA以及2-DG、TM與3-MA合用組作用不同時間（24、36、48h）對人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2的增殖抑制作用。結果顯示，2-DG、TM與3-MA合用組人鼻咽癌細胞存活率明顯降低，均低于單用組，與陰性對照組比較均有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 0.1mmol·L~(-1)3-MA和（或）0.5mmol·L~(-1)2-DG、0.1μmol·L~(-1)TM刺激細胞，采用集落克隆形成實驗檢測藥物對人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用的影響。結果表明：2-DG、TM在低濃度即可明顯抑制CNE-1、CNE-2細胞的集落克隆形成，3-MA增強2-DG、TM的抑制作用。 2．5mmol·L~(-1)2-DG、1μmol·L~(-1)TM、1mmol·L~(-1)3-MA以及合用組處理人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-224h，線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）檢測結果顯示：陽性對照藥CCCP（50μmol·L~(-1)）處理細胞20min，與陰性對照組比較細胞的紅色熒光向綠色熒光轉變比較明顯，單用組沒有觀察到紅色熒光向綠色熒光轉變，合用組紅色熒光向綠色熒光轉變也比較明顯；DAPI染色熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)學的變化，合用組人鼻咽癌CNE-1、CNE-2細胞表現(xiàn)為細胞核皺縮濃集而呈亮藍色熒光，或核呈分葉，碎片狀；而在陰性對照組中及單獨處理組中未發(fā)現(xiàn)異常形態(tài)的細胞核表現(xiàn)，可見細胞核輪廓清晰圓滑，發(fā)出淡藍色熒光，結構均一。 3．Western blotting法檢測自噬相關蛋白beclin1、LC3的變化，結果顯示：陰性對照組人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2中，自噬反應處于較低水平，自噬相關蛋白beclin1表達較多，自噬相關蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉化；而經過2-DG或TM處理組出現(xiàn)較強的自噬反應，自噬相關蛋白beclin1較對照組高，自噬相關蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉化明顯減少。3-MA與2-DG、TM聯(lián)合處理組自噬相關蛋白beclin1表達明顯降低，自噬相關蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉化與2-DG、TM組比較明顯減少。Immunocytochemistry法進一步觀察了自噬相關蛋白的beclin1表達，與Westernblotting結果一致。 結論： 1. DDP、IR對人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2具有增殖抑制作用，且隨著劑量（或濃度）的增加和作用時間的延長，細胞存活率逐漸降低，但細胞對DDP、IR誘導的凋亡不敏感。作用機制可能與DDP、IR誘導的內質網應激所誘發(fā)的自噬的保護作用相關。 2.自噬抑制劑3-MA對人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2具有增殖抑制作用，且隨著劑量（或濃度）的增加和作用時間的延長，細胞存活率逐漸降低。3-MA增強DDP、IR對人鼻咽癌細胞的增殖抑制及誘導凋亡作用。作用機制可能與自噬抑制劑抑制細胞產生自噬相關。 3.自噬抑制劑3-MA增強內質網應激誘導劑2-DG、TM對人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2的增殖抑制及誘導凋亡作用，減弱內質網應激誘導劑誘導的自噬。進一步表明了人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2對DDP、IR的不敏感性可能來自于內質網應激誘導的自噬所產生的保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R739.63

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本文編號：2029137