本文選題：角膜肌成纖維細胞 + 多西環(huán)素�。� 參考：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：角膜獨特的解剖結(jié)構(gòu)使其充當(dāng)著眼睛的第一個折射媒介,完成了90%以上的屈光功能,對形成視覺極其重要,任何眼部疾患一旦影響了角膜的透明性即可造成視力障礙。因此,維持角膜的透明性是視力正常的重要保證。當(dāng)角膜因各種內(nèi)外因素(如炎癥、感染、眼外傷、自身免疫性疾病或腫瘤等)損傷后,在愈合過程中常常因改變了角膜結(jié)構(gòu)的有序性而導(dǎo)致角膜透明性的改變[1],促使角膜瘢痕的形成,從而影響視力。 Berryhill,B.L.、Wilson, S.E.、Netto, M.V.等在相關(guān)研究中證實角膜基質(zhì)細胞向肌成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)化是角膜瘢痕形成的主要機制,在細胞轉(zhuǎn)化過程中各種細胞因子、炎癥因子及趨化因子等是關(guān)鍵的影響因素。利用有效手段調(diào)節(jié)角膜基質(zhì)細胞在不同表型之間的相互轉(zhuǎn)化,或抑制角膜肌成纖維的增殖,是防治角膜瘢痕形成的關(guān)鍵[6]。多西環(huán)素為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的廣譜抑制劑,可抑制MMP的活性及MMP和L-1[7]的合成。近年來,多西環(huán)素在抑制角膜細胞遷移、增殖及抗角膜新生血管形成中的作用越來越多地受到人們的關(guān)注。為此,我們通過研究多西環(huán)素對體外培養(yǎng)的牛角膜肌成纖維細胞增殖及相關(guān)蛋白表達的影響,為臨床上探索安全有效的抑制角膜瘢痕的藥物提供理論依據(jù)。 第一章牛角膜肌成纖維細胞的分離培養(yǎng) 目的：分離培養(yǎng)牛角膜肌成纖維細胞,為下一步實驗提供所需的細胞模型。 方法：分別用基礎(chǔ)培養(yǎng)液配制的1.0mg/ml及2.0mg/ml Ⅰ型膠原酶對牛角膜基質(zhì)層進行二步消化分離,制成細胞懸液后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中用RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)培養(yǎng)。采用臺盼藍染色(TrypanBlue)檢測消化分離后細胞存活率；倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察細胞的生長狀態(tài)；取生長良好的細胞進行波形蛋白(Vimentin)免疫細胞化學(xué)染色以確定所培養(yǎng)的細胞來自角膜基質(zhì)層。在細胞傳代培養(yǎng)的同時,進行a-SMA (alpha-smooth muscle actin,a-平滑肌肌動蛋白)免疫熒光細胞化學(xué)染色,呈陽性表現(xiàn)的細胞為角膜肌成纖維細胞。四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測細胞增殖情況；取處于對數(shù)期的細胞,繪制細胞生長曲線并計算細胞群倍增時間。結(jié)果：在體外成功分離培養(yǎng)牛角膜肌成纖維細胞,顯微鏡下觀察及免疫組織化學(xué)染色后證實所培養(yǎng)的細胞為角膜肌成纖維細胞。臺盼藍染色,細胞即刻成活率達93.5%。細胞生長曲線近似“S”形,其群體倍增時間為38.70h。 結(jié)論：此細胞培養(yǎng)技術(shù)簡便、經(jīng)濟、高效,為原代培養(yǎng)角膜肌成纖維細胞提供了有效渠道。 第二章多西環(huán)素對體外培養(yǎng)的牛角膜肌成纖維細胞增殖的影響 目的：研究多西環(huán)素(Doxycycline, DOX)對體外培養(yǎng)的牛角膜肌成纖維細胞增殖的影響,并探討其作用機制。 方法：1.選用生長良好的牛角膜肌成纖維細胞進行實驗分組：根據(jù)實驗設(shè)計分三大實驗組：陰性對照組(無藥物干預(yù)),陽性對照組(地塞米松120mg/L)及各濃度梯度(10mg/L、20mmg/L、40mmg/L、60mg/L及80mg/L)多西環(huán)素藥物干預(yù)組。2.指標測定：采用MTT法、流式細胞儀細胞周期分析技術(shù)測定各實驗組在對角膜肌成纖維細胞干預(yù)24h和48h后,對細胞的增殖、細胞周期時相分布的影響。 結(jié)果：1.MTT法顯示：在DOX的干預(yù)下,活性角膜肌成纖維細胞的數(shù)量均有不同程度的下降,并呈濃度及時間依賴性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。同一時間段,當(dāng)藥物濃度達60mg/L時與陽性對照組兩兩比較,作用效果高于陽性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.流式細胞儀細胞周期分析顯示：DOX可改變角膜肌成纖維細胞在周期各時相的分布,對GO-G1期有顯著阻滯作用,并呈濃度及時間依賴性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。DOX濃度達60mg/L時作用效果與陽性對照組無明顯差異(P0.05)。 結(jié)論：在10～80mg/L濃度范圍內(nèi),DOX對體外培養(yǎng)的牛角膜肌成纖維細胞的增殖具有明顯的抑制作用,呈劑量-時間-效應(yīng)依賴性。在藥物濃度達到60mg/L時與120mg/L DXM擁有相當(dāng)?shù)淖饔眯Ч?第三章多西環(huán)素對體外培養(yǎng)的牛角膜肌成纖維細胞AgNORs增生及a-SMA表達的抑制作用 目的：通過研究多西環(huán)素(Doxycycline, DOX)對角膜肌成纖維細胞相關(guān)蛋白合成及表達的影響,旨在從細胞分子水平探索抑制角膜瘢痕發(fā)生發(fā)展的機制。 方法：1.選用生長良好的牛角膜肌成纖維細胞進行實驗分組：根據(jù)實驗設(shè)計分三大實驗組：陰性對照組(無藥物干預(yù)),陽性對照組(地塞米松120mg/L)及各濃度梯度(10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L及80mg/L)多西環(huán)素藥物干預(yù)組。2.指標測定：采用核仁組成區(qū)嗜銀蛋白染色(AgNORs)及a-SMA免疫熒光細胞化學(xué)染色等技術(shù)測定各實驗組在對角膜肌成纖維細胞干預(yù)24h和48h后,對細胞DNA復(fù)制及a-SMA合成的影響。 結(jié)果：1.AgNORs染色顯示：DOX藥物濃度組AgNORs合成較陰性對照組明顯減少,并呈濃度及時間依賴性,當(dāng)藥物濃度達60mg/L時作用效果與陽性對照組無明顯差異(P0.05)。2.a-SMA免疫熒光細胞化學(xué)染色后通過病理圖像分析儀測定,行熒光定量分析：DXM藥物干預(yù)組對a-SMA的合成無明顯作用(P0.05)；DOX藥物干預(yù)組可抑制角膜肌成纖維細胞中a-SMA的合成,且呈濃度及時間依賴性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：在10～80mg/L濃度范圍內(nèi),DOX可抑制體外培養(yǎng)的牛角膜肌成纖維細胞的AgNORs增生,呈劑量-時間-效應(yīng)依賴性；在藥物濃度達到60mg/L時與120mg/L DXM擁有相當(dāng)?shù)淖饔眯Ч�。DOX同時具有抑制細胞合成a-SMA的作用,與DXM比較,對抑制角膜瘢痕的形成更具研究價值。
[Abstract]:The cornea ' s unique anatomy makes it act as the first refractive medium of the eye , completes more than 90 % of the refractive power , and can cause visual impairment once the cornea is formed . Therefore , the cornea transparency is an important guarantee for the normal vision .

Berryhill , B . L . , Wilson , S . E . , Netto , M . V . et al . have shown that the phenotypic transformation of corneal stromal cells into myofibroblasts is the main mechanism of corneal scarring . As a broad - spectrum inhibitor of matrix metalloproteinase ( MMP ) , the role of polycytolysin in inhibiting corneal cell migration , proliferation and corneal neovascularization has been paid more and more attention in recent years .

Chapter 1 Isolation and culture of bovine corneal muscle fibroblasts

Objective : To isolate and culture bovine corneal muscle fibroblasts and provide the required cell model for the next step .

Methods : The bovine corneal stroma was digested with 1.0 mg / ml and 2.0 mg / ml collagenase type 鈪，

本文編號：1959274