本文選題：腺病毒 + 腺相關(guān)病毒　； 參考：《復(fù)旦大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：低等脊椎動物如鳥類、魚類的內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷后能夠終生再生,而哺乳動物耳蝸毛細(xì)胞無自發(fā)性再生能力,因此毛細(xì)胞丟失所導(dǎo)致的感音神經(jīng)性耳聾目前仍是臨床治療中的一大難題。另外一方面,上百種基因突變引起的遺傳性耳聾目前沒有治療方法。因此,研究毛細(xì)胞再生以及內(nèi)耳基因?qū)敕椒ǖ陌l(fā)展成為重獲聽覺的焦點。分子生物學(xué)研究的發(fā)展為毛細(xì)胞再生帶來了希望,內(nèi)耳的基因治療和外源性基因的導(dǎo)入,為耳聾的治療帶來了新的手段。腺病毒及腺相關(guān)病毒是內(nèi)耳基因治療常見的載體。為了驗證合適的基因治療的載體,我們使用新近發(fā)展的納升級顯微操作導(dǎo)入系統(tǒng),大范圍的在體研究了12種不同血清型的AAV作為基因載體導(dǎo)入的可行性,我們發(fā)現(xiàn)在新生鼠和成年鼠中,不同血清型的AAV可以轉(zhuǎn)染不同的內(nèi)耳感覺上皮細(xì)胞,包括支持細(xì)胞和毛細(xì)胞。我們還發(fā)現(xiàn)在新生鼠(P1/P2)給予內(nèi)耳注射AAV可以持續(xù)表達(dá)較長時間,而對聽力的影響很小(0-15dB)。這種方法可以用來作為早期內(nèi)耳發(fā)育過程中基因功能缺失所致的遺傳性耳聾的基因治療手段。 在胚胎期的內(nèi)耳毛細(xì)胞及支持細(xì)胞的前體細(xì)胞中選擇性敲除Rbl可產(chǎn)生數(shù)量遠(yuǎn)超出正常情況的前體細(xì)胞,這些細(xì)胞可進(jìn)一步分化成毛細(xì)胞和支持細(xì)胞。但Rb1敲除后誘導(dǎo)毛細(xì)胞和支持細(xì)胞增殖是年齡相關(guān)性的,其具體引起增殖的時間截點如何?即Rbl敲除對不同年齡段內(nèi)耳感覺上皮細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期的功能如何?是否可以結(jié)合其他內(nèi)耳前體細(xì)胞基因可以讓更成熟甚至成年的哺乳動物毛細(xì)胞、支持細(xì)胞增殖?本研究擬行5型腺病毒經(jīng)中階路徑注射轉(zhuǎn)染新生和成年小鼠耳蝸毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的評價；以Er-Cre Rb loxp/loxp系統(tǒng)結(jié)合腺病毒為載體攜帶Cre來敲除Rbl并過表達(dá)內(nèi)耳前體細(xì)胞基因ISL1誘導(dǎo)新生及成年小鼠耳蝸毛細(xì)胞與支持細(xì)胞的增殖的研究。 第一部分：5型腺病毒經(jīng)中階路徑注射轉(zhuǎn)染新生和成年小鼠耳蝸毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的評價 [目的]為了研究5型腺病毒攜帶目的基因經(jīng)新生和成年小鼠中階入路導(dǎo)入轉(zhuǎn)染內(nèi)耳細(xì)胞的可行性,為以小鼠為動物模型的內(nèi)耳基因治療提供實驗基礎(chǔ)和解剖學(xué)依據(jù). [方法]采用納升級顯微操作系統(tǒng),經(jīng)中階顯微注射攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein EGFP)基因的5型重組腺病毒或人工內(nèi)淋巴液于各年齡段的小鼠耳蝸(p1,p4,p7,p12,p21,1-2M),內(nèi)耳注射4天后取雙側(cè)耳蝸標(biāo)本做基底膜鋪片,觀察EGFP表達(dá)情況。 [結(jié)果]p1、P4、P7組：術(shù)后第4天見耳蝸底圈、中圈支持細(xì)胞表達(dá)GFP。p12、p21、1-2M組：術(shù)后第4天可見耳蝸底圈、中圈支持細(xì)胞及部分內(nèi)毛細(xì)胞表達(dá)EGFP。在人工內(nèi)淋巴液和未注射耳,未見EGFP表達(dá)。 [結(jié)論]采用經(jīng)中階入路顯微注射5型腺病毒攜帶目的基因?qū)胄律蠹俺赡晔竽軌驅(qū)⒛康幕虺晒D(zhuǎn)染至耳蝸組織并表達(dá)。 第二部分：12種腺相關(guān)病毒經(jīng)中階路徑注射轉(zhuǎn)染新生和成年小鼠耳蝸毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的比較 [目的]為了比較12種腺相關(guān)病毒攜帶目的基因經(jīng)新生和成年小鼠中階入路導(dǎo)入內(nèi)耳的可行性,尋找新的更安全的載體,為以小鼠為動物模型的內(nèi)耳基因治療提供實驗基礎(chǔ)和解剖學(xué)依據(jù)。 [方法]采用經(jīng)中階顯微注射12種腺相關(guān)病毒((AAV1、2、5、6、6.2、7、8、9、rh8、rh10、rh39、rh43))攜帶目的基因?qū)?將攜帶EGFP的腺相關(guān)病毒或人工內(nèi)淋巴液導(dǎo)入小鼠耳蝸。其中新生鼠為p1/p2CD1小鼠,成年鼠為CBA/CAJ。新生鼠在內(nèi)耳注射后1周、2周、3月,成年鼠在1周及3月后分別取雙側(cè)耳蝸標(biāo)本做基底膜鋪片及冰凍切片,觀察EGFP表達(dá)情況。部分新生鼠組在術(shù)后3周行ABR檢測。 [結(jié)果]新生鼠組：術(shù)后第1周、2周、3月可見支持細(xì)胞、毛細(xì)胞、螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)、前庭感覺細(xì)胞表達(dá)EGFP,GFP在術(shù)后1周表達(dá)較弱。術(shù)后ABR示聽力約有0-15dB下降。其中AAV1和AAV2對支持細(xì)胞和毛細(xì)胞的感染效率相對較高。成年鼠組：術(shù)后1周、3月可見支持細(xì)胞、毛細(xì)胞、螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)、前庭感覺細(xì)胞表達(dá)EGFP。其中AAV1、AAV8和AAV9對支持細(xì)胞和毛細(xì)胞的感染效率相對較高。 [結(jié)論]采用經(jīng)中階顯微注射腺相關(guān)病毒攜帶目的基因?qū)胄律蠹俺赡晔竽軌驅(qū)⒛康幕虺晒D(zhuǎn)染至耳蝸組織并表達(dá),其中新生鼠組只有輕微的聽力下降。新生鼠組可選擇AAV1和AAV2作為載體,成年鼠組可選擇AAV1、AAV8和AAV9。 第三部分：敲除Rbl并過表達(dá)ISLl誘導(dǎo)小鼠耳蝸毛細(xì)胞與支持細(xì)胞增殖的體內(nèi)研究 [目的]在體敲除Rbl并過表達(dá)ISL1誘導(dǎo)小鼠耳蝸毛細(xì)胞與支持細(xì)胞增殖的研究。 [方法]采用Er-Cre Rb loxp/loxp轉(zhuǎn)基因鼠,體內(nèi)模型中敲除Rbl基因,研究其對耳蝸毛細(xì)胞及支持細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。以Er-Cre Rb loxp/loxp轉(zhuǎn)基因鼠與ISL1轉(zhuǎn)基因鼠雜交,獲得Er-Cre Rb loxp/loxp ISL1或Rb loxp/loxp ISL1轉(zhuǎn)基因鼠,在體敲除Rbl并過表達(dá)ISL-1,研究其對P1、P4、P5、P7、P12及P21耳蝸毛細(xì)胞及支持細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。 [結(jié)果]在出生后的耳蝸毛細(xì)胞中特異性敲除Rbl基因,可見毛細(xì)胞和支持細(xì)胞在P4前能重新進(jìn)入細(xì)胞周期,P5、P7、P12及P21未見毛細(xì)胞和支持細(xì)胞增殖。ISL1過表達(dá)在新生鼠和成年鼠中均未見毛細(xì)胞和支持細(xì)胞增殖,Rb1敲除聯(lián)合ISL1過表達(dá),也未見P4之后的毛細(xì)胞和支持細(xì)胞增殖。 [結(jié)論]Rb1基因敲除誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞和支持細(xì)胞增殖呈年齡相關(guān)性,Rb1敲除聯(lián)合ISL1過表達(dá)也未能使得P4之后的毛細(xì)胞和支持細(xì)胞增殖。
[Abstract]:Lower vertebrates, such as birds, can regenerate for life after injury to the inner ear hair cells of the fish, and the mammalian cochlear hair cells have no spontaneous regeneration. Therefore, the sensorineural deafness caused by the loss of hair cells is still a major problem in clinical treatment. On the other hand, the hereditary deafness caused by hundreds of mutations in the gene is present. There is no treatment. Therefore, the development of hair cell regeneration and the development of the inner ear gene introduction have become the focus of hearing. The development of molecular biology has brought hope for the regeneration of hair cells. The gene therapy of the inner ear and the introduction of exogenous genes have brought new means for the treatment of deafness. Internal ear gene therapy is a common carrier. In order to verify the suitable vector for gene therapy, we use the newly developed nanoscale micromanipulation introduction system. We have studied the feasibility of the introduction of 12 different serotype AAV as gene carriers in a wide range. We found that different serotypes of AAV can be transferred in both newborn and adult rats. We also found that the injection of AAV in the newborn rats (P1/P2) to the inner ear can continue to express a long time and have little effect on hearing (0-15dB). This method can be used as a genetic deafness gene in the early development of the inner ear. Treatment.
The selective knockout of Rbl in the embryonic period of the inner ear hair cells and the progenitor cells of the support cells can produce a number of precursors that are far beyond the normal condition. These cells can further differentiate into hair cells and support cells. But after Rb1 knockout, the proliferation of hair cells and supporting cells is age-related, and the time cut is specific to the proliferation of cells. What is the function of Rbl knockout of the reentry function of sensory epithelial cells in the inner ear of different ages? Is it possible to combine other inner ear cells to allow more mature and adult mammalian hair cells to support cell proliferation? This study intends to transfect new and adult small adenoviruses through the midorder pathway of the 5 adenovirus. The evaluation of mouse cochlear hair cells and supporting cells; using Er-Cre Rb loxp/loxp system combined with adenovirus as a carrier to knock out Rbl and overexpress the gene ISL1 of the inner ear cells to induce the proliferation of cochlear hair cells and support cells in adult mice.
Part I: evaluation of the transfection of type 5 adenovirus into the cochlear hair cells and Sertoli cells of newborn and adult mice via middle route injection.
[Objective] to study the feasibility of transfection of the target gene of type 5 adenovirus carrying target gene into the inner ear cells through the middle order approach of new and adult mice, and to provide the experimental basis and anatomical basis for the internal ear gene therapy of mice as animal models.
[Methods] using the nanoscale micromanipulation system, the Enhanced Green Fluorescent Protein EGFP gene was injected into the cochlea (P1, P4, P7, p12, p21,1-2M) with the enhanced green fluorescent protein (Fluorescent Protein EGFP) gene, and the cochlear specimens were taken as basal membrane for 4 days after the inner ear injection. The expression of EGFP was observed.
[results]p1, P4, P7 group: the cochlear cochlea was seen on the fourth day after operation, and the middle ring support cells expressed GFP.p12. Group p21,1-2M: the cochlear cochlea was seen on the fourth day after operation. The middle ring support cells and some inner hair cells expressed EGFP. in the artificial lymph and uninjected ears, and no EGFP expression was found.
[Conclusion] the transfection of target genes into the cochlear tissues and expression of the target gene can be successfully transfected into the cochlear tissues by the introduction of the target gene carrying the target gene of the 5 type adenovirus.
The second part: comparison of 12 kinds of adeno-associated virus transfection into the cochlear hair cells and Sertoli cells of newborn and adult mice by middle route injection.
[Objective] to compare the feasibility of 12 adeno-related viruses carrying the target gene into the inner ear through the middle order approach of new and adult mice, to find a new and safer carrier and provide experimental basis and anatomical basis for the internal ear gene therapy of mice as animal model.
[Methods] 12 kinds of adeno-related viruses ((AAV1,2,5,6,6.2,7,8,9, rh8, rh10, rh39, rh43)) were introduced into the mouse cochlea with the adeno-related virus or artificial lymphatic fluid carrying EGFP. The newborn rats were p1/p2CD1 mice, and adult mice were injected with CBA/CAJ. newborn rats for 1 weeks, 2 weeks, March, and adult mice. After 1 weeks and March, bilateral cochlear specimens were taken for basement membrane preparation and frozen sections to observe the expression of EGFP. ABR was detected at 3 weeks after operation.
[results] first weeks, 2 weeks after operation, support cells, hair cells, spiral ligaments, spiral ganglion, vestibular sensory cells were expressed EGFP, and GFP was expressed weakly at 1 weeks after operation. 0-15dB decreased in ABR hearing after operation. Among them, the infection efficiency of AAV1 and AAV2 on support cells and capillary cells was relatively high. Adult rats: 1 weeks after operation, 3 Support cells, hair cells, spiral ligaments, spiral ganglion, vestibular sensory cells express EGFP. in this month, and AAV1, AAV8 and AAV9 are relatively efficient in the infection of support cells and hair cells.
[Conclusion] the target gene can be transfected into the cochlear tissue and expressed in the new rat and adult rat with the target gene of the midorder microinjection gland associated virus. The newborn rat group has only a slight hearing loss. The newborn rat group can choose AAV1 and AAV2 as the carrier, and the adult mouse group can choose AAV1, AAV8 and AAV9..
The third part: knocking out Rbl and overexpressing ISLl to induce the proliferation of cochlear hair cells and Sertoli cells in mice.
[Objective] in vivo knockdown of Rbl and overexpression of ISL1 induced the proliferation of cochlear hair cells and Sertoli cells in mice.
[Methods] the Er-Cre Rb loxp/loxp transgenic mice were used, and the Rbl gene was knocked out in the body model, and the promotion of the cochlear hair cells and the proliferation of the support cells was studied. The Er-Cre Rb loxp/loxp ISL1 or the transgenic mice were obtained by the hybridization of the Er-Cre Rb loxp/loxp transgenic mice and the ISL1 transgenic mice. To study the effects of P1, P4, P5, P7, P12 and P21 on the proliferation of hair cells and Sertoli cells in cochlea.
[results] the Rbl gene was specifically knocked out in the cochlear hair cells after birth. It was found that hair cells and supporting cells could reenter the cell cycle before P4. P5, P7, P12 and P21 did not see the proliferation of hair cells and support cells in the proliferation of hair cells and support cells in both newborn and adult rats. Rb1 knockout combined ISL1 overexpression, nor did Rb1 knock out. The proliferation of hair cells and supporting cells after P4 was seen.
[conclusion]Rb1 knockout induced cochlear hair cells and support cell proliferation is age-related. Rb1 knockout combined with ISL1 overexpression can not induce the proliferation of hair cells and support cells after P4.

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R764

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本文編號：1885817