本文選題：Cx46G143R + 基因突變　； 參考：《蘭州大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：間隙連接蛋白(Connexin,Cx)是一類存在于細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì),是構(gòu)成間隙連接通道、半通道的基本組成單位。六個(gè)間隙連接蛋白單體聚合在一起形成間隙連接子表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)膜表面,又稱為半通道。兩個(gè)相鄰細(xì)胞膜表面的間隙連接子相互對(duì)接形成跨膜的間隙連接通道。數(shù)十個(gè)到上萬(wàn)個(gè)間隙連接通道能夠在細(xì)胞表面聚集形成間隙連接斑。間隙連接通道和半通道允許小分子物質(zhì)(分子量1kDa)在細(xì)胞之間、或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間進(jìn)行交換傳遞。 間隙連接蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞通訊在維持晶狀體的滲透性,代謝穩(wěn)態(tài)以及晶狀體的透明性等方面起到了重要的作用。近年來(lái)研究表明,表達(dá)在晶狀體纖維細(xì)胞的間隙連接蛋白(Cx46和Cx50)基因突變與人類遺傳性白內(nèi)障密切相關(guān)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過(guò)20個(gè)Cx46基因突變與家族遺傳性白內(nèi)障相關(guān),這些Cx46基因突變型會(huì)通過(guò)影響間隙連接通道的形成和功能,或者半通道的通透性等導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生。 Cx46’第143位氨基酸的突變(甘氨酸突變?yōu)榫彼?Cx46G143R)是首次在Cx46蛋白細(xì)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)上發(fā)現(xiàn)的基因突變,該點(diǎn)突變與我國(guó)一個(gè)遺傳性先天性Coppock白內(nèi)障(核性顆粒狀白內(nèi)障)的發(fā)生相關(guān),然而其致病分子機(jī)制還不明確。本文首次對(duì)Cx46細(xì)胞內(nèi)環(huán)區(qū)域突變引起遺傳性白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了研究。 通過(guò)多序列對(duì)比的方法分析了位于Cx46氨基酸序列第143位的甘氨酸,發(fā)現(xiàn)該甘氨酸在不同物種的Cx46蛋白以及人類其他的間隙連接蛋白中均高度保守,對(duì)間隙連接蛋白的形成和／或功能具有重要的意義。為了研究Cx46G143R是否影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程,我們克隆了Cx46野生型和Cx46G143R突變型基因,構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,Western blot和免疫熒光染色結(jié)果顯不Cx46G143R與Cx46野生型一樣,均能夠成功地表達(dá)在HeLa細(xì)胞,并且在細(xì)胞內(nèi)的分布相似,都能在細(xì)胞表面形成間隙連接斑。 為了確定該突變型對(duì)間隙連接通道的形成以及功能是否有影響,使用劃痕染料轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)和微注射染料轉(zhuǎn)移法檢測(cè)了通道功能,結(jié)果顯示Cx46G143R突變型降低了間隙連接通道的染料傳遞能力。當(dāng)Cx46G143R突變型與Cx46野生型共表達(dá)在HeLa細(xì)胞上時(shí),該突變會(huì)呈現(xiàn)顯性負(fù)性作用。同樣,將Cx46G143R表達(dá)在配對(duì)的非洲爪蟾卵母細(xì)胞后,使用雙電極電壓鉗技術(shù)檢測(cè)間隙連接通道間的電流,結(jié)果顯示該突變同樣以顯性負(fù)性方式使間隙連接通道喪失電耦合作用。通過(guò)Triton X-100提取實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了間隙連接斑的形成,發(fā)現(xiàn)Cx46G143R在細(xì)胞表面形成的間隙連接斑多于Cx46野生型,說(shuō)明該突變不是通過(guò)影響間隙連接通道的形成而改變其功能。 間隙連接子除了形成間隙連接通道,也可以在細(xì)胞表面構(gòu)成有功能的半通道。本文使用染料吸收實(shí)驗(yàn)分析了Cx46G143R對(duì)半通道功能的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同于對(duì)間隙連接通道的作用,Cx46G143R增加了半通道的活性。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面未形成間隙連接通道的連接子的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)該突變導(dǎo)致的半通道活性的增加并不是由于細(xì)胞表面Cx46的表達(dá)增加,相反,該突變導(dǎo)致了細(xì)胞表面Cx46連接子的減少。 為了進(jìn)一步研究Cx46G143R形成的間隙連接通道／半通道功能變化的可能機(jī)制,本文使用Swiss Model分析了Cx46G143R對(duì)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果顯示該突變可能引起Cx46蛋白細(xì)胞內(nèi)環(huán)三維結(jié)構(gòu)的變化,在細(xì)胞內(nèi)環(huán)的第119-131位氨基酸序列上產(chǎn)生了一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)。通過(guò)制備GST-Cx46/Cx46G143R細(xì)胞內(nèi)環(huán)融合蛋白、進(jìn)行Pull-down實(shí)驗(yàn),本文首次研究了Cx46蛋白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)區(qū)域與羧基端的相互作用,結(jié)果顯示Cx46細(xì)胞內(nèi)環(huán)能夠與Cx46蛋白相互結(jié)合,并且與Cx46野生型相比,改變了內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)的Cx46G143R突變型與Cx46蛋白的結(jié)合能力更強(qiáng),這說(shuō)明Cx46G143R可能是通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)與羧基端之間“球和鏈”的相互作用,而引起間隙連接通道／半通道功能的變化。 此外,我們也檢測(cè)了Cx46G143R突變型對(duì)細(xì)胞活性的影響,WST-1實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Cx46G143R能夠降低細(xì)胞的生存能力。用Annexin V和PI標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行流式分析,發(fā)現(xiàn)Cx46G143R通過(guò)半通道功能的改變,增加了細(xì)胞凋亡,同時(shí)也喪失了Cx46野生型抵抗氧化應(yīng)激的能力。 綜上所述,Cx46介導(dǎo)的細(xì)胞通訊對(duì)于晶狀體纖維細(xì)胞間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物質(zhì)的傳遞,維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有重要的作用。Cx46G143R突變可能通過(guò)增加Cx46蛋白羧基端與細(xì)胞內(nèi)環(huán)的相互作用,引起間隙連接通道功能的抑制和半通道的開(kāi)放,導(dǎo)致細(xì)胞活性降低、凋亡增加,從而參與遺傳性白內(nèi)障的發(fā)病。
[Abstract]:Connexin ( Cx ) is a kind of protein present on the surface of cell membrane . It is the basic unit of gap junction channel and half - channel . The gap junction between the two adjacent cell membrane surfaces forms the gap junction channel across the membrane . The gap junction channel and the half channel allow small molecule matter ( molecular weight 1 kDa ) to exchange between cells or between the cells and the extracellular matrix .

Intergap junction protein - mediated cellular communication plays an important role in maintaining the permeability , metabolic homeostasis , and transparency of the lens . In recent years , it has been shown that the gene mutation of Cx46 and Cx50 is closely related to human genetic cataract .

The mutation of Cx46 ' s 143 amino acid ( glycine mutation is arginine , Cx46G143R ) is the first gene mutation found on the inner ring structure of Cx46 protein . The mutation of Cx46 ' is related to the occurrence of a hereditary congenital Coppock cataract in our country .

In order to study whether Cx46G143R affects the transcription and translation of protein , we cloned Cx46 wild - type and Cx46G143R mutant genes . In order to study whether Cx46G143R affects the transcription and translation process of protein , we cloned Cx46 wild - type and Cx46G143R mutant genes .

It was found that Cx46G143R had a dominant negative effect when Cx46G143R mutant was co - expressed with Cx46 wild type in HeLa cells .

The effect of Cx46G143R on the half - channel function was analyzed by dye - absorption experiments . The result showed that Cx46G143R increased the activity of the half - channel by detecting the effect of Cx46G143R on the half - channel function .

The effect of Cx46G143R on the three - dimensional structure of Cx46 protein was investigated by Swiss Model .

In addition , we also examined the effect of Cx46G143R mutation on cell activity . The results showed that Cx46G143R was able to reduce cell viability by flow cytometry . It was found that Cx46G143R increased apoptosis by half - channel function , and also lost the ability of Cx46 wild - type to resist oxidative stress .

In conclusion , Cx46 - mediated cellular communication plays an important role in the transmission of nutrients and metabolic substances between the cells . Cx46G143R mutation may increase the interaction between the carboxy terminal of Cx46 protein and the inner ring of cells , which may lead to the inhibition of the function of gap junction channel and the opening of the half - channel , resulting in decreased cell activity and increased apoptosis , thereby participating in the pathogenesis of hereditary cataract .

【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R776.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1858446