本文選題：視皮層 + 雙眼形覺(jué)剝奪　； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：弱視是指在視覺(jué)發(fā)育敏感期，由于缺乏清晰視覺(jué)圖象刺激，從而造成矯正視力低于正常的疾病。弱視發(fā)病率高，視功能低下給患者的工作、學(xué)習(xí)和生活帶來(lái)諸多困難。成人弱視發(fā)病率為2.9%，是20-70歲人群?jiǎn)窝垡暳p害的首要原因。弱視的發(fā)展和治療與視皮層可塑性密切相關(guān)。在可塑性關(guān)鍵期內(nèi)，采取適當(dāng)?shù)闹委煼椒苁谷跻暬颊叩囊暪δ芑謴?fù)；當(dāng)可塑性關(guān)鍵期終止后(8-12歲以后)，雖然異常的視覺(jué)環(huán)境不能引起弱視，但弱視導(dǎo)致的視功能損害無(wú)法恢復(fù)。因此對(duì)視皮層可塑性機(jī)理進(jìn)行研究，將進(jìn)一步認(rèn)識(shí)弱視的發(fā)病機(jī)制，并為提高成年弱視治愈率和開(kāi)發(fā)弱視治療的藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 當(dāng)視皮層可塑性關(guān)鍵期終止時(shí)，視皮層細(xì)胞外間質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)中的硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulphate proteoglycans, CSPGs)等分子逐漸聚集并包繞神經(jīng)元胞體和樹(shù)突形成神經(jīng)元周?chē)W(wǎng)絡(luò)(perineuronal net, PNNs)，主要包繞于Parvalbumin (PV)陽(yáng)性神經(jīng)元周?chē)２捎胏hABC酶降解成年大鼠視皮層中的CSPGs后可以成功恢復(fù)視皮層眼優(yōu)勢(shì)柱的移動(dòng)，并降低了視皮層γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)能神經(jīng)元的抑制作用。CSPGs有共同的核心蛋白，并由膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元共同分泌，能夠抑制軸突的生長(zhǎng)和再生。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)隨著視覺(jué)發(fā)育，正常大鼠視皮層神經(jīng)元GABA受體介導(dǎo)的抑制性突觸傳遞增強(qiáng)。應(yīng)用chABC酶(chondroitinase ABC)降解大鼠視皮層PNNs中的CSPGs，并結(jié)合腦片膜片鉗全細(xì)胞記錄率先發(fā)現(xiàn)：ChABC酶處理組大鼠視皮層Ⅳ層神經(jīng)元PSCs各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)顯著變化，說(shuō)明ChABC酶通過(guò)降解CSPGs并不影響視皮層Ⅳ層突觸傳遞特性，但特異性地影響了GABAA介導(dǎo)的抑制性突觸傳遞。上述結(jié)果提示CSPGs對(duì)視皮層發(fā)育可塑性關(guān)鍵期終止的作用可能是GABA能神經(jīng)環(huán)路成熟和發(fā)揮抑制效應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。雖然既往研究觀(guān)察到CSPGs是視皮層可塑性終止的關(guān)鍵因素，但并沒(méi)有進(jìn)一步探討CSPGs發(fā)揮抑制作用的分子機(jī)制。 最新研究表明：酪氨酸磷酸酶蛋白受體σ (protein tyrosine phosphatase σ， PTPσ)為CSPGs發(fā)揮抑制軸突生長(zhǎng)作用的特異性受體。PTPσ是白細(xì)胞抗原家族成員，由類(lèi)免疫球蛋白(Ig)和纖維結(jié)合素Ⅲ (FNⅢ)重復(fù)片段等構(gòu)成。該受體廣泛分布于腺體和神經(jīng)系統(tǒng)(高表達(dá)于海馬，大腦皮質(zhì)，嗅球，視網(wǎng)膜，室管膜下層)，參與了神經(jīng)的發(fā)育及再生：主要表現(xiàn)為抑制軸突生長(zhǎng)和參與膠質(zhì)瘢痕的形成。PTPσ具有保守、正電荷胞外結(jié)構(gòu)域，研究表明CSPGs中帶負(fù)電荷的多糖鏈—硫酸軟骨素(CS)正是PTPσ的結(jié)合位點(diǎn)。與ChABC酶降解CSPGs后的效果類(lèi)似，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)即使CSPGs存在，功能性地刪除編碼PTPσ的基因Ptprs后，神經(jīng)軸突仍然能夠繼續(xù)生長(zhǎng)。在體實(shí)驗(yàn)也證實(shí)：Ptprs基因敲除動(dòng)物脊髓背根節(jié)神經(jīng)元軸突能夠穿過(guò)脊髓損傷后CSPGs密集的瘢痕區(qū)域并繼續(xù)生長(zhǎng)。 之前的大量研究已經(jīng)證實(shí)了PTPσ能夠負(fù)向性地調(diào)節(jié)軸突的生長(zhǎng)，但PTPσ受體的下游底物或胞內(nèi)信號(hào)通路如何抑制軸突的生長(zhǎng)和樹(shù)突的形成，目前并不十分清楚。既往研究表明，肌動(dòng)蛋白(actin)和視皮層可塑性的分子機(jī)制關(guān)系十分密切。神經(jīng)元的細(xì)胞骨架包括微絲、微管及神經(jīng)絲，這三種成分中只有含肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的微絲在發(fā)育神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)錐和成熟神經(jīng)系統(tǒng)的樹(shù)突棘中發(fā)現(xiàn)。生長(zhǎng)錐是個(gè)活躍運(yùn)動(dòng)的微觀(guān)結(jié)構(gòu)，其與神經(jīng)突起的發(fā)生和生長(zhǎng)、軸突的特殊途徑選擇，以及突觸的形成有關(guān)，且神經(jīng)突起的生長(zhǎng)、延伸只發(fā)生在生長(zhǎng)錐。研究發(fā)現(xiàn)作為突觸局部細(xì)胞黏附分子(Synapticallylocalized cell adhesion molecules, SAMs)的成員，N-cadherin存在于突觸前后末端，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和β-catenin結(jié)合，而后者則與α-catenin結(jié)合，從而使N-cadherin和actin形成連接。通過(guò)控制突觸蛋白的聚集和樹(shù)突棘的形態(tài)，N-cadherin和catenin蛋白參與了突觸連接成熟的過(guò)程。Siu等研究發(fā)現(xiàn)，背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元高度表達(dá)內(nèi)源性的N-cadherin和PTPσ，且能夠調(diào)控神經(jīng)元生長(zhǎng)錐的延伸。 結(jié)合上述內(nèi)容我們提出假設(shè)：PTPσ參與了視皮層可塑性的終止，其機(jī)制與介導(dǎo)CSPGs對(duì)PV陽(yáng)性神經(jīng)元的調(diào)控作用有關(guān)，而PTPσ及其下游通路分子N-cadherin和β-catenin的表達(dá)變化是成年大鼠視皮層可塑性再激活的重要分子機(jī)制。 為此，本課題采用以下技術(shù)和方法，在大鼠視覺(jué)可塑性關(guān)鍵期及其終止前后，以及成年可塑性再激活狀態(tài)下，探討視皮層PTPσ與視覺(jué)發(fā)育可塑性關(guān)鍵期終止的關(guān)系及其可能存在的分子機(jī)制。 方法 1、應(yīng)用熒光定量PCR觀(guān)察PTPσ mRNA水平在發(fā)育前后的變化，以及免疫熒光組織化學(xué)研究PTPσ受體在視皮層中的表達(dá)和分布隨發(fā)育的變化情況 2、應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)分別雙重標(biāo)記PTPσ和PNNs、PTPσ和PV陽(yáng)性神經(jīng)元，同時(shí)采用免疫熒光組織化學(xué)三重標(biāo)記PV、PNNs、PTPσ，研究視皮層可塑性關(guān)鍵期的終止前后，PTPσ分別與PNNs、PV神經(jīng)元在視皮層的共表達(dá)情況與發(fā)育之間的關(guān)系。 3、建立雙眼形覺(jué)剝奪模型再激活成年大鼠視皮層可塑性后，采用免疫熒光組織化學(xué)觀(guān)察PTPσ、PV、PNNs的表達(dá)情況。同時(shí)應(yīng)用熒光定量PCR分別觀(guān)察PTPσ、N-cadherin和β-catenin mRNA水平隨發(fā)育以及在成年視皮層可塑性激活后的變化情況。 結(jié)果 1、PTPσ受體在視皮層可塑性關(guān)鍵期前后的表達(dá)和分布 (1)在大鼠出生后1周，PTPσ表達(dá)位于高水平，但在出生后3周以后，各層均顯著下降，維持在低水平，說(shuō)明PTPσ的表達(dá)呈現(xiàn)一定的視覺(jué)經(jīng)驗(yàn)依賴(lài)性。 (2) PTPσ表達(dá)在可塑性關(guān)鍵期結(jié)束后，到成年期又升高恢復(fù)至可塑性開(kāi)始時(shí)的水平，這為PTPσ參與視皮層可塑性關(guān)鍵期的“終止”提供了證據(jù)。 (3) PTPσ在其陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)定位于胞膜、胞漿及軸突。視皮層Ⅱ-Ⅲ層、Ⅳ層、Ⅴ-Ⅵ層均可見(jiàn)PTPσ陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，但各組均以Ⅴ-Ⅵ層表達(dá)最多。而視皮層中PTPσ陽(yáng)性細(xì)胞絕大部分為神經(jīng)元。 2、PTPσ受體調(diào)控Parvalbumin陽(yáng)性神經(jīng)元終止視皮層可塑性的研究 (1)絕大部分PNN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)PTPσ，提示視皮層中CSPGs可能通過(guò)PTPσ受體調(diào)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)育及成熟，并發(fā)揮抑制軸突生長(zhǎng)的效應(yīng)，是可塑性終止的重要分子機(jī)制。 (2)大部分PV陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)PTPσ，提示在視皮層發(fā)育過(guò)程中PTPσ可能參與了PV神經(jīng)元功能的調(diào)控，并一直持續(xù)到可塑性終止后至成年。同時(shí)，PV/PTPσ雙標(biāo)細(xì)胞在Ⅳ層最多，而在其他層較少，這與PNN/PTPσ雙標(biāo)細(xì)胞以及PNNs的分布特點(diǎn)相一致。 (3)視皮層中PV和PTPσ都為陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)元也同時(shí)被PNN包繞，這一現(xiàn)象為PTPσ受體與CSPGs結(jié)合后發(fā)揮抑制PV神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)及形成突觸聯(lián)系的效應(yīng)提供了形態(tài)學(xué)證據(jù)。而視皮層IV層PV/PNN/PTPσ三標(biāo)陽(yáng)性神經(jīng)元在PV神經(jīng)元中的比例至PW9時(shí)最高，說(shuō)明在視皮層發(fā)育過(guò)程中PTPσ逐漸參與了CSPGs對(duì)PV神經(jīng)元的調(diào)控，可能是視皮層可塑性關(guān)鍵期終止的重要機(jī)制。 3、PTPσ受體及其下游通路分子參與成年大鼠視皮層可塑性再激活及其機(jī)制的研究 (1)雙眼形覺(jué)剝奪后的大鼠與同齡成年大鼠相比，視皮層PTPσ mRNA明顯下降，PTPσ陽(yáng)性細(xì)胞密度在視皮層各層均明顯減少，說(shuō)明雙眼形覺(jué)剝奪14天后降低了視皮層內(nèi)PTPσ的表達(dá)水平。 (2)雙眼形覺(jué)剝奪14天的大鼠與同齡成年大鼠相比，視皮層各層中PV神經(jīng)元的數(shù)量并無(wú)明顯變化。 (3)雙眼形覺(jué)剝奪14天大鼠與同齡成年大鼠相比，視皮層與可塑性關(guān)系密切的Ⅱ-Ⅲ層、Ⅳ層CSPGs水平明顯下降，說(shuō)明成年大鼠視皮層可塑性再激活與CSPGs有關(guān)。 (4)視皮層N-cadherin mRNA的表達(dá)在PW1時(shí)最高隨后下降，在PW7(可塑性終止前)再次出現(xiàn)高峰，并在成年后降至低水平，說(shuō)明視皮層內(nèi)N-cadherin mRNA的表達(dá)受到年齡及視覺(jué)經(jīng)驗(yàn)等因素的影響，與可塑性終止有關(guān)。但雙眼形覺(jué)剝奪14天對(duì)視皮層N-cadherin mRNA表達(dá)與同齡成年大鼠相比無(wú)明顯變化。 (5)視皮層β-catenin mRNA的表達(dá)在PW1時(shí)最高隨后下降，，在PW7(可塑性終止前)再次出現(xiàn)高峰，并在成年后降至低水平，說(shuō)明視皮層內(nèi)β-catenin mRNA的表達(dá)受到年齡及視覺(jué)經(jīng)驗(yàn)等因素的影響，與可塑性終止有關(guān)。然而，與同齡成年大鼠相比，雙眼形覺(jué)剝奪14天能夠使視皮層β-catenin mRNA表達(dá)升高。 結(jié)論 1.本實(shí)驗(yàn)首次揭示了出生后視皮層PTPσ受體的表達(dá)在可塑性關(guān)鍵期前后的發(fā)育變化，發(fā)現(xiàn)： PTPσ在出生后早期表達(dá)位于高水平，但在進(jìn)入可塑性關(guān)鍵期后顯著下降，維持在低水平，但當(dāng)可塑性結(jié)束后，到成年期又升高恢復(fù)至可塑性開(kāi)始時(shí)的水平。首次揭示PTPσ受體參與了視皮層可塑性關(guān)鍵期的“終止”。 2.在視皮層發(fā)育過(guò)程中大部分PV陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)PTPσ，并一直持續(xù)到可塑性終止后至成年，提示在視皮層發(fā)育過(guò)程中PTPσ可能參與了PV神經(jīng)元功能的調(diào)控。率先在組織水平上發(fā)現(xiàn)：視皮層中PV和PTPσ都為陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)元也同時(shí)被PNN包繞，而視皮層IV層PV/PNN/PTPσ三標(biāo)陽(yáng)性神經(jīng)元在PV神經(jīng)元中的比例由關(guān)鍵期開(kāi)始的最低值上升至成年期時(shí)的最高值，提示在視皮層發(fā)育過(guò)程中PTPσ逐漸參與了CSPGs對(duì)PV神經(jīng)元的調(diào)控，是視皮層可塑性關(guān)鍵期終止的重要機(jī)制。 3.本實(shí)驗(yàn)率先發(fā)現(xiàn)雙眼形覺(jué)剝奪14天使成年大鼠視皮層PTPσ、CSPGs表達(dá)明顯下降，提示雙眼形覺(jué)剝奪導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)中的CSPGs及其受體PTPσ的減少，削弱了CSPGs的抑制效應(yīng)，可能是成年大鼠視皮層可塑性“再激活”的機(jī)制之一。 4.視皮層β-catenin mRNA的表達(dá)在出生后早期最高隨后下降，在可塑性終止前再次出現(xiàn)高峰，于成年后降至低水平，提示視皮層內(nèi)β-catenin mRNA的表達(dá)受到年齡及視覺(jué)經(jīng)驗(yàn)等因素的影響，與可塑性終止相關(guān)。率先發(fā)現(xiàn)雙眼形覺(jué)剝奪能夠使成年大鼠視皮層β-catenin mRNA表達(dá)升高，有利于促進(jìn)了神經(jīng)元突起生長(zhǎng)，是成年大鼠可塑性“再激活”的機(jī)制之一。
[Abstract]:The incidence of amblyopia is 2.9 % , which is the primary cause of single - eye visual impairment in the 20 - 70 year - old population . The development and treatment of amblyopia are closely related to the plasticity of visual cortex .
After termination of the plasticity critical period ( after 8 - 12 years ) , although the abnormal visual environment can not cause amblyopia , the visual function damage caused by amblyopia cannot be recovered . Therefore , the research on the plasticity mechanism of the visual cortex will further recognize the pathogenesis of amblyopia , and lay an experimental foundation for improving the cure rate of adult amblyopia and developing drugs for amblyopia treatment .

CSPGs ( CSPGs ) were used to degrade CSPGs in the visual cortex of rats .

PTP 蟽 is a member of leukocyte antigen family , which is composed of immunoglobulin ( Ig ) and fibronectin 鈪

本文編號(hào)：1833134