本文選題：視皮層 + 雙眼形覺剝奪　； 參考：《第三軍醫(yī)大學》2012年博士論文

【摘要】：弱視是指在視覺發(fā)育敏感期，由于缺乏清晰視覺圖象刺激，從而造成矯正視力低于正常的疾病。弱視發(fā)病率高，視功能低下給患者的工作、學習和生活帶來諸多困難。成人弱視發(fā)病率為2.9%，是20-70歲人群單眼視力損害的首要原因。弱視的發(fā)展和治療與視皮層可塑性密切相關。在可塑性關鍵期內，采取適當?shù)闹委煼椒苁谷跻暬颊叩囊暪δ芑謴�；當可塑性關鍵期終止后(8-12歲以后)，雖然異常的視覺環(huán)境不能引起弱視，但弱視導致的視功能損害無法恢復。因此對視皮層可塑性機理進行研究，將進一步認識弱視的發(fā)病機制，并為提高成年弱視治愈率和開發(fā)弱視治療的藥物奠定實驗基礎。 當視皮層可塑性關鍵期終止時，視皮層細胞外間質(Extracellular matrix, ECM)中的硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulphate proteoglycans, CSPGs)等分子逐漸聚集并包繞神經(jīng)元胞體和樹突形成神經(jīng)元周圍網(wǎng)絡(perineuronal net, PNNs)，主要包繞于Parvalbumin (PV)陽性神經(jīng)元周圍。采用chABC酶降解成年大鼠視皮層中的CSPGs后可以成功恢復視皮層眼優(yōu)勢柱的移動，并降低了視皮層γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)能神經(jīng)元的抑制作用。CSPGs有共同的核心蛋白，并由膠質細胞和神經(jīng)元共同分泌，能夠抑制軸突的生長和再生。本實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)隨著視覺發(fā)育，正常大鼠視皮層神經(jīng)元GABA受體介導的抑制性突觸傳遞增強。應用chABC酶(chondroitinase ABC)降解大鼠視皮層PNNs中的CSPGs，并結合腦片膜片鉗全細胞記錄率先發(fā)現(xiàn)：ChABC酶處理組大鼠視皮層Ⅳ層神經(jīng)元PSCs各項指標無顯著變化，說明ChABC酶通過降解CSPGs并不影響視皮層Ⅳ層突觸傳遞特性，但特異性地影響了GABAA介導的抑制性突觸傳遞。上述結果提示CSPGs對視皮層發(fā)育可塑性關鍵期終止的作用可能是GABA能神經(jīng)環(huán)路成熟和發(fā)揮抑制效應的結構基礎。雖然既往研究觀察到CSPGs是視皮層可塑性終止的關鍵因素，但并沒有進一步探討CSPGs發(fā)揮抑制作用的分子機制。 最新研究表明：酪氨酸磷酸酶蛋白受體σ (protein tyrosine phosphatase σ， PTPσ)為CSPGs發(fā)揮抑制軸突生長作用的特異性受體。PTPσ是白細胞抗原家族成員，由類免疫球蛋白(Ig)和纖維結合素Ⅲ (FNⅢ)重復片段等構成。該受體廣泛分布于腺體和神經(jīng)系統(tǒng)(高表達于海馬，大腦皮質，嗅球，視網(wǎng)膜，室管膜下層)，參與了神經(jīng)的發(fā)育及再生：主要表現(xiàn)為抑制軸突生長和參與膠質瘢痕的形成。PTPσ具有保守、正電荷胞外結構域，研究表明CSPGs中帶負電荷的多糖鏈—硫酸軟骨素(CS)正是PTPσ的結合位點。與ChABC酶降解CSPGs后的效果類似，體外實驗發(fā)現(xiàn)即使CSPGs存在，功能性地刪除編碼PTPσ的基因Ptprs后，神經(jīng)軸突仍然能夠繼續(xù)生長。在體實驗也證實：Ptprs基因敲除動物脊髓背根節(jié)神經(jīng)元軸突能夠穿過脊髓損傷后CSPGs密集的瘢痕區(qū)域并繼續(xù)生長。 之前的大量研究已經(jīng)證實了PTPσ能夠負向性地調節(jié)軸突的生長，但PTPσ受體的下游底物或胞內信號通路如何抑制軸突的生長和樹突的形成，目前并不十分清楚。既往研究表明，肌動蛋白(actin)和視皮層可塑性的分子機制關系十分密切。神經(jīng)元的細胞骨架包括微絲、微管及神經(jīng)絲，這三種成分中只有含肌動蛋白網(wǎng)絡的微絲在發(fā)育神經(jīng)系統(tǒng)的生長錐和成熟神經(jīng)系統(tǒng)的樹突棘中發(fā)現(xiàn)。生長錐是個活躍運動的微觀結構，其與神經(jīng)突起的發(fā)生和生長、軸突的特殊途徑選擇，以及突觸的形成有關，且神經(jīng)突起的生長、延伸只發(fā)生在生長錐。研究發(fā)現(xiàn)作為突觸局部細胞黏附分子(Synapticallylocalized cell adhesion molecules, SAMs)的成員，N-cadherin存在于突觸前后末端，其胞內結構域和β-catenin結合，而后者則與α-catenin結合，從而使N-cadherin和actin形成連接。通過控制突觸蛋白的聚集和樹突棘的形態(tài)，N-cadherin和catenin蛋白參與了突觸連接成熟的過程。Siu等研究發(fā)現(xiàn)，背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元高度表達內源性的N-cadherin和PTPσ，且能夠調控神經(jīng)元生長錐的延伸。 結合上述內容我們提出假設：PTPσ參與了視皮層可塑性的終止，其機制與介導CSPGs對PV陽性神經(jīng)元的調控作用有關，而PTPσ及其下游通路分子N-cadherin和β-catenin的表達變化是成年大鼠視皮層可塑性再激活的重要分子機制。 為此，本課題采用以下技術和方法，在大鼠視覺可塑性關鍵期及其終止前后，以及成年可塑性再激活狀態(tài)下，探討視皮層PTPσ與視覺發(fā)育可塑性關鍵期終止的關系及其可能存在的分子機制。 方法 1、應用熒光定量PCR觀察PTPσ mRNA水平在發(fā)育前后的變化，以及免疫熒光組織化學研究PTPσ受體在視皮層中的表達和分布隨發(fā)育的變化情況 2、應用免疫組織化學技術分別雙重標記PTPσ和PNNs、PTPσ和PV陽性神經(jīng)元，同時采用免疫熒光組織化學三重標記PV、PNNs、PTPσ，研究視皮層可塑性關鍵期的終止前后，PTPσ分別與PNNs、PV神經(jīng)元在視皮層的共表達情況與發(fā)育之間的關系。 3、建立雙眼形覺剝奪模型再激活成年大鼠視皮層可塑性后，采用免疫熒光組織化學觀察PTPσ、PV、PNNs的表達情況。同時應用熒光定量PCR分別觀察PTPσ、N-cadherin和β-catenin mRNA水平隨發(fā)育以及在成年視皮層可塑性激活后的變化情況。 結果 1、PTPσ受體在視皮層可塑性關鍵期前后的表達和分布 (1)在大鼠出生后1周，PTPσ表達位于高水平，但在出生后3周以后，各層均顯著下降，維持在低水平，說明PTPσ的表達呈現(xiàn)一定的視覺經(jīng)驗依賴性。 (2) PTPσ表達在可塑性關鍵期結束后，到成年期又升高恢復至可塑性開始時的水平，這為PTPσ參與視皮層可塑性關鍵期的“終止”提供了證據(jù)。 (3) PTPσ在其陽性表達細胞內表達定位于胞膜、胞漿及軸突。視皮層Ⅱ-Ⅲ層、Ⅳ層、Ⅴ-Ⅵ層均可見PTPσ陽性細胞表達，但各組均以Ⅴ-Ⅵ層表達最多。而視皮層中PTPσ陽性細胞絕大部分為神經(jīng)元。 2、PTPσ受體調控Parvalbumin陽性神經(jīng)元終止視皮層可塑性的研究 (1)絕大部分PNN陽性細胞表達PTPσ，提示視皮層中CSPGs可能通過PTPσ受體調節(jié)神經(jīng)元的發(fā)育及成熟，并發(fā)揮抑制軸突生長的效應，是可塑性終止的重要分子機制。 (2)大部分PV陽性神經(jīng)元表達PTPσ，提示在視皮層發(fā)育過程中PTPσ可能參與了PV神經(jīng)元功能的調控，并一直持續(xù)到可塑性終止后至成年。同時，PV/PTPσ雙標細胞在Ⅳ層最多，而在其他層較少，這與PNN/PTPσ雙標細胞以及PNNs的分布特點相一致。 (3)視皮層中PV和PTPσ都為陽性表達的神經(jīng)元也同時被PNN包繞，這一現(xiàn)象為PTPσ受體與CSPGs結合后發(fā)揮抑制PV神經(jīng)元軸突生長及形成突觸聯(lián)系的效應提供了形態(tài)學證據(jù)。而視皮層IV層PV/PNN/PTPσ三標陽性神經(jīng)元在PV神經(jīng)元中的比例至PW9時最高，說明在視皮層發(fā)育過程中PTPσ逐漸參與了CSPGs對PV神經(jīng)元的調控，可能是視皮層可塑性關鍵期終止的重要機制。 3、PTPσ受體及其下游通路分子參與成年大鼠視皮層可塑性再激活及其機制的研究 (1)雙眼形覺剝奪后的大鼠與同齡成年大鼠相比，視皮層PTPσ mRNA明顯下降，PTPσ陽性細胞密度在視皮層各層均明顯減少，說明雙眼形覺剝奪14天后降低了視皮層內PTPσ的表達水平。 (2)雙眼形覺剝奪14天的大鼠與同齡成年大鼠相比，視皮層各層中PV神經(jīng)元的數(shù)量并無明顯變化。 (3)雙眼形覺剝奪14天大鼠與同齡成年大鼠相比，視皮層與可塑性關系密切的Ⅱ-Ⅲ層、Ⅳ層CSPGs水平明顯下降，說明成年大鼠視皮層可塑性再激活與CSPGs有關。 (4)視皮層N-cadherin mRNA的表達在PW1時最高隨后下降，在PW7(可塑性終止前)再次出現(xiàn)高峰，并在成年后降至低水平，說明視皮層內N-cadherin mRNA的表達受到年齡及視覺經(jīng)驗等因素的影響，與可塑性終止有關。但雙眼形覺剝奪14天對視皮層N-cadherin mRNA表達與同齡成年大鼠相比無明顯變化。 (5)視皮層β-catenin mRNA的表達在PW1時最高隨后下降，，在PW7(可塑性終止前)再次出現(xiàn)高峰，并在成年后降至低水平，說明視皮層內β-catenin mRNA的表達受到年齡及視覺經(jīng)驗等因素的影響，與可塑性終止有關。然而，與同齡成年大鼠相比，雙眼形覺剝奪14天能夠使視皮層β-catenin mRNA表達升高。 結論 1.本實驗首次揭示了出生后視皮層PTPσ受體的表達在可塑性關鍵期前后的發(fā)育變化，發(fā)現(xiàn)： PTPσ在出生后早期表達位于高水平，但在進入可塑性關鍵期后顯著下降，維持在低水平，但當可塑性結束后，到成年期又升高恢復至可塑性開始時的水平。首次揭示PTPσ受體參與了視皮層可塑性關鍵期的“終止”。 2.在視皮層發(fā)育過程中大部分PV陽性神經(jīng)元表達PTPσ，并一直持續(xù)到可塑性終止后至成年，提示在視皮層發(fā)育過程中PTPσ可能參與了PV神經(jīng)元功能的調控。率先在組織水平上發(fā)現(xiàn)：視皮層中PV和PTPσ都為陽性表達的神經(jīng)元也同時被PNN包繞，而視皮層IV層PV/PNN/PTPσ三標陽性神經(jīng)元在PV神經(jīng)元中的比例由關鍵期開始的最低值上升至成年期時的最高值，提示在視皮層發(fā)育過程中PTPσ逐漸參與了CSPGs對PV神經(jīng)元的調控，是視皮層可塑性關鍵期終止的重要機制。 3.本實驗率先發(fā)現(xiàn)雙眼形覺剝奪14天使成年大鼠視皮層PTPσ、CSPGs表達明顯下降，提示雙眼形覺剝奪導致細胞外基質中的CSPGs及其受體PTPσ的減少，削弱了CSPGs的抑制效應，可能是成年大鼠視皮層可塑性“再激活”的機制之一。 4.視皮層β-catenin mRNA的表達在出生后早期最高隨后下降，在可塑性終止前再次出現(xiàn)高峰，于成年后降至低水平，提示視皮層內β-catenin mRNA的表達受到年齡及視覺經(jīng)驗等因素的影響，與可塑性終止相關。率先發(fā)現(xiàn)雙眼形覺剝奪能夠使成年大鼠視皮層β-catenin mRNA表達升高，有利于促進了神經(jīng)元突起生長，是成年大鼠可塑性“再激活”的機制之一。
[Abstract]:The incidence of amblyopia is 2.9 % , which is the primary cause of single - eye visual impairment in the 20 - 70 year - old population . The development and treatment of amblyopia are closely related to the plasticity of visual cortex .
After termination of the plasticity critical period ( after 8 - 12 years ) , although the abnormal visual environment can not cause amblyopia , the visual function damage caused by amblyopia cannot be recovered . Therefore , the research on the plasticity mechanism of the visual cortex will further recognize the pathogenesis of amblyopia , and lay an experimental foundation for improving the cure rate of adult amblyopia and developing drugs for amblyopia treatment .

CSPGs ( CSPGs ) were used to degrade CSPGs in the visual cortex of rats .

PTP 蟽 is a member of leukocyte antigen family , which is composed of immunoglobulin ( Ig ) and fibronectin 鈪

本文編號：1833134