本文選題：角膜 + 損傷修復(fù)��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：研究背景 正常透明的角膜是由角膜上皮層,前彈力層,基質(zhì)層,后彈力層和內(nèi)皮層五部分組成,約占眼外層纖維膜的1/6,表面被淚膜覆蓋,無(wú)新生血管和淋巴管。其中角膜上皮層是由4-6層非角化的復(fù)層鱗狀上皮緊密排列而成。角膜上皮層厚度為O.05mmm.占整個(gè)角膜厚度的5%,角膜緣上皮基底層含有角膜緣干細(xì)胞,可逐漸分化為瞬間擴(kuò)充細(xì)胞及終末分化上皮細(xì)胞,是角膜上皮增殖和修復(fù)的來(lái)源,其生命周期大約7-14天。角膜上皮層可分為細(xì)胞層和基底膜,細(xì)胞層包括基底細(xì)胞,翼狀細(xì)胞和表層細(xì)胞�；啄な怯苫咨掀ぜ�(xì)胞持續(xù)分泌,在其下形成由Ⅳ型膠原纖維,層粘連蛋白和其他蛋白組成的50nm厚的一層膜。淺表上皮細(xì)胞之間的緊密連接可阻止淚液中的水分進(jìn)入基底層,角膜上皮大范圍缺損時(shí)可導(dǎo)致角膜水腫增厚角膜透明性下降嚴(yán)重影響視力。 完整的角膜上皮是眼球抵御病原微生物侵襲的第一道屏障,也是維持良好視覺(jué)的必需條件。角膜上皮像機(jī)體其他上皮組織一樣,容易不斷遭受外界的物理,化學(xué)和生物等有害因子的侵襲,導(dǎo)致?lián)p傷和失去屏障功能。臨床上,外傷、感染和手術(shù)等常易導(dǎo)致角膜上皮損傷,從而導(dǎo)致角膜新生血管角膜白斑及角膜潰瘍穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥,嚴(yán)重影響視力。角膜上皮損傷合理的修復(fù)對(duì)于維持角膜透明和清晰視覺(jué)具有至關(guān)重要作用。角膜上皮損傷修復(fù)涉及細(xì)胞增殖及分化，細(xì)胞遷徙,基質(zhì)結(jié)構(gòu)重建等一系列過(guò)程,而這些過(guò)程由不斷釋放的rhEGF, bFGF等相關(guān)生長(zhǎng)因子進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。這些生長(zhǎng)因子對(duì)于角膜上皮損傷修復(fù)具有重要作用。 臨床上,角膜上皮損傷十分常見(jiàn),常用的生長(zhǎng)因子類(lèi)藥物中有：重組人表皮生長(zhǎng)因子(recombinant human epithelial growth factor,rhEGF)和重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(recombinant bovine basic fibroblast growth factor, bFGF),均對(duì)角膜上皮損傷修復(fù)治療具有一定的效果。 目前研究發(fā)現(xiàn),rhEGF和bFGF均可促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù),但兩者的機(jī)制及側(cè)重點(diǎn)不同：EGF促修復(fù)的機(jī)制主要是與鄰近創(chuàng)面基底細(xì)胞膜上的EGF受體結(jié)合,促進(jìn)角膜緣基底膜細(xì)胞向表層移行,先形成單細(xì)胞層,然后經(jīng)有絲分裂形成復(fù)層上皮細(xì)胞而加速角膜創(chuàng)面的上皮化。bFGF主要是通過(guò)促分裂效應(yīng)和非促分裂的激素樣活性,特別是通過(guò)激活角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞分裂增殖活性,使膠原纖維分泌增加、毛細(xì)血管增多和管腔擴(kuò)張,而發(fā)揮促修復(fù)作用。然而,bFGF可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化,誘導(dǎo)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞侵入三維膠原基質(zhì)中,形成類(lèi)似于毛細(xì)血管的管樣結(jié)構(gòu),促進(jìn)角膜血管新生。 因此,明確rhEGF與bFGF促進(jìn)角膜上皮損傷修復(fù)效果,以及是否誘導(dǎo)角膜新生血管和角膜瘢痕,對(duì)于更合理、更安全地指導(dǎo)臨床用藥,確定其臨床應(yīng)用的最佳時(shí)機(jī)具有重要意義,本論文從體外細(xì)胞增殖及遷徙實(shí)驗(yàn)著手,結(jié)合體內(nèi)角膜上皮損傷修復(fù)及血管新生動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究,為兩者效果及不良反應(yīng)的深入研究奠定基礎(chǔ)。 研究目的 1.從體外實(shí)驗(yàn)初步探討重組人表皮生長(zhǎng)因子(Recombinant Human Epithelial Growth Factor,rhEGF)和重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)對(duì)角膜上皮細(xì)胞,基質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,遷徙作用影響。 2.從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步探討重組人表皮生長(zhǎng)因子rhEGF與重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF對(duì)角膜上皮損傷修復(fù)及血管新生的影響。 研究方法 1.體外實(shí)驗(yàn)：(1).首先應(yīng)用MTT方法篩選rhEGF與bFGF促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞SD-HCEC1增殖的最佳濃度,即在96孔板中接種SD-HCEC1,每孔加角膜上皮細(xì)胞懸液200ul,1000個(gè)細(xì)胞/孔,每5個(gè)孔一組,培養(yǎng)24h后,分別更換下列培養(yǎng)液：含0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/mlrhEGF和含0ng/m1.2.5ng/ml,5ng/m1.10ng/ml,20ng/ml,40ng/mlbFGF的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液,在5孔未加細(xì)胞的空白孔中加200ul培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。每天換液,5天后MTT檢測(cè)SD-HCEC1細(xì)胞增殖情況。 (2).然后分別觀察該最佳濃度下應(yīng)用MTT方法檢測(cè)角膜上皮細(xì)胞(SD-HCEC1)、角膜基質(zhì)細(xì)胞(RKCs)和人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的增殖情況。消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,離心、計(jì)數(shù)和重懸制備細(xì)胞懸液,接種到96孔板中,SD-HCEC1和RKCs每孔1000個(gè)細(xì)胞,P3代的HUVECs每孔5000個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h后,分別換成含10ng/mlrhEGF, bFGF和兩者都不含的角膜上皮,基質(zhì)和血管內(nèi)皮培養(yǎng)液,每隔24h,每代細(xì)胞隨機(jī)取5孔,加入5ug/ml MTT試劑20ul,培養(yǎng)箱中孵育4h后,輕輕吸出上清液,PBS輕輕洗滌一次,加入150ulDMSO,酶標(biāo)儀檢測(cè)溶液的光密度值(OD值)SD-HCEC1和RKCs的檢測(cè)波長(zhǎng)570nm.校正波長(zhǎng)630nm,HUVECs的檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),以O(shè)D值為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞增殖曲線。 (3).rhEGF與bFGF作用于SD-HCEC1, RKCs, HUVECs后的平板克隆形成檢測(cè)。消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,離心、計(jì)數(shù)和重懸后,接種到六孔板中,每孔接種100個(gè)SD-HCEC1s細(xì)胞,RKCs細(xì)胞每孔200個(gè)細(xì)胞,HUVECs每孔1500個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),隔日半量換液。培養(yǎng)一周后,吸出培養(yǎng)液,用PBS輕輕漂洗后,加入固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)固定20min。PBS沖洗,經(jīng)過(guò)Giemsa染液(1：10稀釋)染色1Omin,自來(lái)水沖洗后,在光鏡下觀察細(xì)胞克隆形態(tài),計(jì)算克隆數(shù)(8個(gè)細(xì)胞為一個(gè)克隆)和克隆形成率=克隆數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)×100% (4).rhEGF與bFGF作用于SD-HCEC1, RKCs, HUVECs的ki67流式檢測(cè)。將SD-HCEC1細(xì)胞懸液吹打均勻,計(jì)數(shù),平均接種到五個(gè)大皿中,24h后,其中四個(gè)皿分別換液為含10ng/mlrhEGF,10ng/ml bFGF,20ng/mlbFGF和不含rhEGF, bFGF的角膜上皮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h,消化收集細(xì)胞,PBS洗1次后離心5min,固定液固定15min,PBS洗1次,破膜液15min,PBS洗1次,加入1：100一抗,,37℃孵育30min,PBS洗1次,加入熒光二抗1：100,37℃孵育20min,PBS洗1次,每個(gè)大皿分裝成3個(gè)EP管,定容至100μl,上機(jī)檢測(cè),重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。RKCs, HUVECs則分別換液為10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF和不含rhEGF, bFGF的角膜基質(zhì)和血管內(nèi)皮培養(yǎng)液作用48h,余方法同上。 (5).10n∥mlrhEGF和bFGF作用于HUVECs后的遷移能力檢測(cè)。將原代培養(yǎng)的第4代HUVECs接種于六孔板中,每孔接種的密度為1×107個(gè)/ml,待細(xì)胞增長(zhǎng)基本融合后,用20ul的無(wú)菌槍頭在每孔中間垂直劃一道直線,PBS沖洗后,分別加入含0.10ng/mlrhEGF和10ng/mlbFGF的M199血管內(nèi)皮培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),每組選四個(gè)固定觀察點(diǎn),定期拍照觀察,應(yīng)用Image J軟件處理分析結(jié)果,未愈合率=觀察時(shí)未愈合面積/Oh未愈合面積×100%。 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建角膜中央上皮損傷及角膜新生血管新西蘭白兔動(dòng)物模型,將新西蘭白兔隨機(jī)分為三組(每組五只眼)：rhEGF組,bFGF組和生理鹽水組(NS)。從術(shù)后第1天開(kāi)始分別滴用易貝滴眼液(重組人表皮生長(zhǎng)因子,rhEGF)、貝復(fù)蘇滴眼液(堿性成纖維生長(zhǎng)因子,bFGF)和生理鹽水(NS),1滴/次,4次/日,觀察角膜上皮損傷修復(fù)及新生血管面積變化。 結(jié)果 1.rhEGF與bFGF促進(jìn)SDHCEC1最佳作用濃度均為10ng/ml(1.356±0.218,,2.056±0.210)。 2.MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1).對(duì)于SD-HCEC1的增殖,10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF和不含rhEGF與bFGF的Negative Control三組間差異經(jīng)析因設(shè)計(jì)方差分析存在顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=51.800,P=0.000)。10ng/mlbFGF(P=0.000)與10ng/mlrhEGF (P=0.048)促進(jìn)SD-HCEC1s細(xì)胞增殖較NegativeControl強(qiáng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(2).對(duì)于RKCs的增殖,10ng/mlrhEGF,10ng/ml bFGF和Negative Control三組間差異經(jīng)析因設(shè)計(jì)方差分析存在顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.604,P=0.000)。第1至3天,10ng/mlbFGF促進(jìn)RKCs增殖效果不明顯,從第4天開(kāi)始10ng/mlbFGF增殖效果開(kāi)始增快,10ng/mlrhEGF促進(jìn)RKCs增殖與Negative Control比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.263),提示rhEGF7天內(nèi)無(wú)明顯促進(jìn)RKCs增殖作用,bFGF晚期促進(jìn)RKCs增殖效果較好。(3).對(duì)于HUVECs增殖,10ng/mlbFGF與10ng/mlrhEGF與Negative Control三組間經(jīng)析因設(shè)計(jì)方差分析存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=958.247,P=0.000)。10ng/mlbFGF與10ng/mlrhEGF促進(jìn)HUVECs增殖較Negative Control強(qiáng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000),第2天開(kāi)始,10ng/mlbFGF促進(jìn)HUVECs增殖效果持續(xù)較強(qiáng),提示bFGF促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖效果較強(qiáng)。 3.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1).10ng/mlrhEGF,10ng/ml和20ng/mlbFGF和Negative Control四組間SD-HCEC1s細(xì)胞克隆數(shù)經(jīng)Kruskal-Wallis Test有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=8.538,v=3,P=0.036)。其中,四組的Mean rank分別為10.67.7.83.2.67,4.83,提示1Ong/mlrhEGF促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞SD-HCEC1克隆形成效果最好,10ng/mlbFGF組效果次之,不過(guò)10ng/mlrhEGF組細(xì)胞克隆形態(tài)較其余三組小。(2).10ng/mlrhEGF,10ng/ml和20ng/mlbFGF和Negative Control四組間RKCs細(xì)胞克隆數(shù)經(jīng)Kruskal-Wallis Test有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=9.100,v=3,P=0.028)。其中四組的Mean rank分別為5.33,7.17,11.00,2.50。提示20ng/mlbFGF促進(jìn)RKCs的克隆形成效果最好,10ng/mlbFGF效果次之,10ng/mlrhEGF效果較差,Negative Control的細(xì)胞克隆形態(tài)最小(3).10ng/mlrhEGF,10ng/ml和20ng/mlbFGF和Negative Control四組間HUVECs的細(xì)胞克隆數(shù)經(jīng)Kruskal-Wallis Test有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=8.390,v=3,P=0.039)。其四組的Mean rank分別為5.00.9.]7.9.50,2.33。提示10ng/ml和20ng/mlbFGF組HUVECs克隆形成效果最好,10ng/mlrhEGF組次之。 4.Ki67流式結(jié)果：(1).10ng/mlrhEGF,10ng/ml和20ng/mlbFGF和NegativeControl四組間SDHCEC1的ki67表達(dá)經(jīng)Kruskal-Wallis Test有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=10.385,v=3,P=0.016),其四組的Mean rank分別為5.00,8.00,11.00,2.00。提示20ng/ml bFGF組與10ng/mlbFGF組促進(jìn)SD-HCEC1的ki67表達(dá)效果最好,10ng/mlrhEGF效果次之。(2).10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF和Negative Control三組間RKCs的ki67表達(dá)經(jīng)Kruskal-Wallis Test有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=7.200,v=2,P=0.027),其三組的Mean rank分別為5.00,8.00,2.00。提示10ng/mlbFGF促進(jìn)RKCs的ki67表達(dá)效果最好,10ng/mlrhEGF效果次之。(3).10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF和Negative Control三組間血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs的ki67表達(dá)經(jīng)Kruskal-Wallis Test具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.489,v=2,P=0.039)。其三組的Mean rank分別為5.33,7.67,2.00。提示10ng/mlbFGF促進(jìn)HUVECs的ki67表達(dá)效果最好,10ng/mlrhEGF效果次之。 5. HUVECs細(xì)胞遷徙實(shí)驗(yàn)結(jié)果：10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF和Negative Control三組間未愈合面積百分比經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1138.752.P=0.000),不同時(shí)間點(diǎn)間(F=959.377.P=0.000)。第8hour和24hour.10ng/mlbFGF與10ng/mlrhEGF組未愈合面積百分比均小于Negative Control具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000),而10ng/mlbFGF組未愈合面積百分比較10ng/mlrhEGF組小也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000),這提示bFGF與rhEGF都能促進(jìn)HUVECs的遷移,而bFGF較rhEGF促進(jìn)HUVECs遷移能力強(qiáng)。 6.角膜上皮損傷愈合結(jié)果：rhEGF, bFGF與NS三組間經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=5.022,P=0.026)。術(shù)后1,2天,rhEGF組角膜上皮愈合率高于NS組(P=0.015)和高于bFGF組(P=0.022)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,bFGF組愈合率較NS高無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.839)。術(shù)后第3天,rhEGF組,bFGF組與NS組角膜上皮愈合率分別為100%±0%,100%±0%,99.50%±0.70%。 7.角膜血管新生實(shí)驗(yàn)結(jié)果：術(shù)后第12,15,18,21day,rhEGF, bFGF與NS三組間角膜新生血管面積經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=4.173,P=0.042),rhEGF組高于NS組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.666)。rhEGF組低于bFGF組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.044)；bFGF組高于NS組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.020)。結(jié)果表明bFGF較rhEGF更具有促進(jìn)角膜血管新生的作用。 結(jié)論 rhEGF與bFGF都具有促進(jìn)角膜上皮損傷修復(fù)的作用,但是rhEGF主要作用于角膜上皮,促進(jìn)角膜血管新生的作用較bFGF弱,bFGF同時(shí)促進(jìn)角膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞增殖。提示如果是單純的角膜上皮損傷短期應(yīng)用,兩者都可以選擇,若促進(jìn)角膜基質(zhì)修復(fù)為重點(diǎn),應(yīng)選用bFGF,但是,若是長(zhǎng)期反復(fù)使用治療角膜上皮缺損或糜爛時(shí),尤其是患眼伴有慢性炎癥刺激者,如干眼病時(shí),建議應(yīng)用rhEGF。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R772.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1820333