本文選題：人角膜上皮種子細(xì)胞 + 去上皮層羊膜��； 參考：《中國(guó)海洋大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：人角膜上皮（Human Corneal Epithelium，HCEP）位于角膜最前端，由多層細(xì)胞構(gòu)成，其組織學(xué)結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)于維持角膜的生理功能至關(guān)重要。人角膜上皮細(xì)胞（Human Corneal Epithelial Cell，HCEPC）是角膜抵御外來(lái)致病因子侵害的第一道重要防線，不僅能維持角膜的透明性，還能吸收氧氣和營(yíng)養(yǎng)為角膜供氧/養(yǎng)。HCEP具有自我更新能力，其完整性和更新能力取決于位于角膜緣基底部的角膜緣干細(xì)胞（LimbalStem Cell，LSC）的不斷增殖與分化。眼球表面的燒傷、灼傷、嚴(yán)重機(jī)械創(chuàng)傷、病原體感染、角膜緣部位冷凍治療、接觸鏡的長(zhǎng)期佩戴以及眼瘢痕性類天皰瘡等各種原因均可導(dǎo)致LSC損傷或功能障礙。角膜緣干細(xì)胞缺陷癥（Limbal Stem Cell Deficiency，LSCD）表現(xiàn)為L(zhǎng)SC增殖能力喪失，導(dǎo)致持續(xù)性角膜上皮缺損、角膜緣屏障功能下降，致使結(jié)膜上皮侵入角膜、新生血管形成，進(jìn)而影響角膜的光學(xué)特性，導(dǎo)致視力受損或致盲。在以前的眼表重建治療中，一般采用角膜上皮成形術(shù)以及自體或異體角膜緣移植的方法，但因供體角膜來(lái)源嚴(yán)重不足以及術(shù)后排斥反應(yīng)發(fā)生率較高，從而限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，角膜組織工程的興起為組織工程人角膜上皮（Tissue-engineered Human Corneal Epithelium，TE-HCEP）的體外重建以及患者通過(guò)臨床角膜上皮移植而重見光明帶來(lái)了希望。TE-HCEP體外重建的關(guān)鍵要素包括結(jié)構(gòu)功能正常的HCEPC種子細(xì)胞的大量獲得和生物相容性理想的載體支架的制備。在種子細(xì)胞方面，由于自體LSC來(lái)源與數(shù)量的限制，而連續(xù)性HCEPC細(xì)胞系因能提供出大量細(xì)胞故被認(rèn)為是TE-HCEP規(guī)�；w外重建的種子細(xì)胞的有效來(lái)源。在業(yè)已建立的HCEPC細(xì)胞系中，癌基因轉(zhuǎn)染的永生化HCEPC細(xì)胞系因具有潛在的致瘤性無(wú)法作為種子細(xì)胞用于TE-HCEP的體外重建尤其是臨床移植，而非轉(zhuǎn)染HCEPC細(xì)胞系因能為理論研究和TE-HCEP提供出足量的正常細(xì)胞，故被認(rèn)為是TE-HCEP種子細(xì)胞的理想來(lái)源。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者成功建立了非轉(zhuǎn)染的連續(xù)性人角膜緣上皮細(xì)胞系，但至今仍未見其用于TE-HCEP體外重建的研究報(bào)道。在載體支架方面，羊膜（Amniotic Membrane，AM）作為一種天然高分子生物材料，為半透明且抗原性低的薄片組織，其基質(zhì)中含有大量的生長(zhǎng)因子和蛋白酶抑制因子以及抗炎癥、抗成纖維化、抗菌、抗血管生成等的相關(guān)蛋白，與HCEPC具有理想的生物相容性并能促進(jìn)HCEPC的細(xì)胞分化，已被廣泛應(yīng)用于眼表重建，因此被認(rèn)為是TE-HCEP的理想載體支架之一。本文在本實(shí)驗(yàn)室自主建立的非轉(zhuǎn)染HCEPC細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，對(duì)此細(xì)胞系的屬性和致瘤性進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，首次以該細(xì)胞為種子細(xì)胞建、以去上皮層羊膜（denuded AM，dAM）為載體支架，開展TE-HCEP的體外重建研究，并利用LSCD新西蘭兔模型對(duì)TE-HCEP在角膜上皮移植中的作用進(jìn)行鑒定，旨在建立TE-HCEP體外重建的技術(shù)工藝條件，獲得可長(zhǎng)期維持兔角膜透明的TE-HCEP，為TE-HCEP替代捐獻(xiàn)角膜用于角膜上皮異常疾病的臨床治療創(chuàng)造條件。 為了進(jìn)一步鑒定非轉(zhuǎn)染HCEPC細(xì)胞系的屬性、功能蛋白的表達(dá)及潛在致瘤性，本文對(duì)第80代HCEPC進(jìn)行了復(fù)蘇、擴(kuò)增培養(yǎng)和鑒定。屬性檢測(cè)結(jié)果顯示，復(fù)蘇的第80代HCEPC透明度高，形態(tài)飽滿，呈圓形或卵圓形，鑲嵌排列呈鋪路狀，細(xì)胞群體倍增時(shí)間為40.75h，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，分裂旺盛，特征性染色體數(shù)目仍為2n=46。功能蛋白的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，該細(xì)胞能夠表達(dá)HCEP特異性標(biāo)志蛋白——角蛋白（keratin）3和12，以及緊密連接蛋白ZO-1、E-鈣粘蛋白、間隙連接蛋白-43、整聯(lián)蛋白β1，表明該細(xì)胞仍具有角膜上皮的表型，且具有形成完整HCEP結(jié)構(gòu)的潛能。致瘤性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，該細(xì)胞無(wú)致瘤性。因此，該細(xì)胞為TE-HCEP體外重建提供了種子細(xì)胞。 為了獲得TE-HCEP體外重建的理想載體支架，本文以新鮮AM為材料，采用胰酶倒置消化法對(duì)其進(jìn)行去上皮層處理，再使用Ⅳ型膠原進(jìn)行包被，并通過(guò)接種HCEPC研究dAM的生物相容性。通過(guò)光鏡、電鏡以及石蠟切片HE染色等方法對(duì)處理后的AM以及HCEPC在經(jīng)包被的dAM上的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了觀察和鑒定，結(jié)果顯示利用胰酶于37℃倒置消化20min，再經(jīng)Ⅳ型膠原包被后獲得的dAM表面平整，無(wú)上皮細(xì)胞殘留，且有基底膜結(jié)構(gòu)；dAM對(duì)HCEPC具有理想的生物相容性，且光學(xué)性能良好。因此，dAM能夠作為理想的載體支架進(jìn)行TE-HCEP的體外重建研究。 為了建立TE-HCEP體外規(guī)�；亟ǖ募夹g(shù)工藝條件，本文以生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HCEPC為種子細(xì)胞，以dAM為載體支架，采用氣-液界面培養(yǎng)法體外重建TE-HCEP。利用石蠟切片HE染色、免疫組織化學(xué)檢測(cè)及電鏡觀察等方法對(duì)重建的TE-HCEP形態(tài)結(jié)構(gòu)、潛在功能等方面進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示TE-HCEP經(jīng)氣-液界面法培養(yǎng)5d后即可形成6~7層的復(fù)層結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)與正常HCEP結(jié)構(gòu)最為相近，且光學(xué)性能良好，表層的HCEPC平整呈卵圓形，且形成了豐富的微絨毛結(jié)構(gòu)。TE-HCEP仍具有HCEP屬性以及形成細(xì)胞間、細(xì)胞與dAM間連接的潛能，超微結(jié)構(gòu)與正常的角膜上皮層結(jié)構(gòu)相近。因此該方法能夠獲得理想的TE-HCEP，有望在將來(lái)進(jìn)行規(guī)�；a(chǎn)。 為了研究體外重建的TE-HCEP在新西蘭兔模型角膜上皮移植中的作用，本文利用DiI標(biāo)記的第80代HCEPC在經(jīng)包被的dAM上進(jìn)行體外重建。根據(jù)改良的三種方法分別制作了LSCD新西蘭兔模型，并利用TE-HCEP分別對(duì)其進(jìn)行角膜上皮移植。利用角膜測(cè)厚、裂隙燈顯微鏡觀察、印跡細(xì)胞學(xué)檢查等方法跟蹤記錄了創(chuàng)傷以及移植后兔模型在體角膜的厚度、透明度、上皮完整性和新生血管情況；利用石蠟切片HE染色、免疫組織化學(xué)、電鏡觀察等方法進(jìn)行TE-HCEP角膜上皮移植效果的離體檢測(cè)。結(jié)果顯示利用堿燒傷、機(jī)械創(chuàng)傷和聯(lián)合法均能獲得LSCD的新西蘭兔模型；利用TE-HCEP對(duì)堿燒傷的LSCD模型進(jìn)行角膜上皮移植，，術(shù)后80d角膜仍為白瓷色，有新生血管；利用TE-HCEP對(duì)機(jī)械創(chuàng)傷獲得的LSCD模型進(jìn)行角膜上皮移植，術(shù)后第12d角膜開始透明，厚度明顯下降，新生血管減少，第25d角膜厚度恢復(fù)到正常眼水平，且能夠長(zhǎng)時(shí)間保持較透明狀態(tài)。術(shù)后120d的離體檢測(cè)結(jié)果顯示角膜上皮細(xì)胞來(lái)源于體外重建的TE-HCEP，約4~5層，角蛋白3表達(dá)呈陽(yáng)性，上皮細(xì)胞之間存在緊密連接結(jié)構(gòu)，與對(duì)照組存在顯著性差異；利用TE-HCEP對(duì)聯(lián)合法獲得的LSCD模型進(jìn)行角膜上皮移植，術(shù)后第12d角膜厚度明顯下降，第49d角膜新生血管明顯減少，第70d角膜厚度恢復(fù)到正常眼水平，角膜長(zhǎng)時(shí)間保持較透明狀態(tài)。術(shù)后147d的離體檢測(cè)結(jié)果顯示角膜上皮細(xì)胞來(lái)源于TE-HCEP，約3~4層，角蛋白3表達(dá)呈陽(yáng)性，上皮細(xì)胞之間存在緊密連接結(jié)構(gòu)并有基底膜結(jié)構(gòu)，與對(duì)照組存在顯著性差異。新西蘭兔角膜上皮移植實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，所移植TE-HCEP形成了形態(tài)結(jié)構(gòu)較正常的角膜上皮層，新生血管明顯減少，并能夠使角膜長(zhǎng)時(shí)間保持較透明狀態(tài)。 綜上所述，本文首次以非轉(zhuǎn)染、無(wú)致瘤性的第80代HCEPC為種子細(xì)胞，以dAM為載體支架，體外重建出了形態(tài)結(jié)構(gòu)和潛在功能與正常HCEP相近的TE-HCEP，其移植后能夠長(zhǎng)時(shí)間保持LSCD兔角膜較透明狀態(tài)。因此，該TE-HCEP有望作為角膜上皮的替代物從根本上解決角膜供體材料嚴(yán)重不足的現(xiàn)狀，為角膜上皮異常疾病的患者帶來(lái)重見光明的希望，這不僅具有重要的理論意義，而且能產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
[Abstract]:Human corneal epithelial cells ( HCEP ) have been used in vitro reconstruction of corneal epithelium ( TE - HCEP ) . Amniotic Membrane ( AM ) is a kind of natural high molecular biological material , which is a semi - transparent and low - antigenicity thin - sheet tissue . It contains a large amount of growth factor and protease inhibitor , as well as anti - inflammation , anti - fibrosis , antibacterial , anti - angiogenesis and other related proteins . It has been widely used in vitro reconstruction of TE - HCEP . The aim of this paper is to establish the TE - HCEP in vitro reconstruction of TE - HCEP .

In order to further identify the properties of non - transfected HCEPC cell lines , the expression of functional protein and the potential oncogenicity of HCEPC cell lines were studied .

In order to obtain the ideal carrier scaffold for the in vitro reconstruction of TE - HCEP , the growth of AM and HCEPC was investigated and identified by trypan inverted digestion with fresh AM as material . The results showed that the growth of AM and HCEPC was studied by light microscope , electron microscope and paraffin section HE staining .
dAM has ideal biocompatibility and good optical performance for HCEPC . Therefore , dAM can be used as an ideal carrier for in vitro reconstruction of TE - HCEP .

In order to establish the technological process conditions for the in vitro large - scale reconstruction of TE - HCEP , the recombinant TE - HCEP was reconstructed in vitro by using HCEPC as seed cell and dAM as carrier . The results showed that the structure of TE - HCEP was similar to normal HCEP structure , and its structure was similar to that of normal HCEP structure . The structure of TE - HCEP was similar to normal HCEP structure .

In order to study the role of TE - HCEP reconstructed in vitro in rabbit model corneal epithelium transplantation in New Zealand , a novel rabbit model of LSCD New Zealand rabbit model was constructed by using DiI - labeled 80 - generation HCEPC in vitro . The corneal epithelium transplantation was performed by using TE - HCEP .
The ex vivo detection of TE - HCEP corneal epithelium transplantation was carried out by means of HE staining , immunohistochemistry and electron microscopy . The results showed that the new Zealand rabbit model with LSCD was obtained by alkali burn , mechanical trauma and combined method .
The corneal epithelium transplantation was performed on the LSCD model of alkali burn by TE - HCEP .
The corneal epithelium transplantation was performed on the LSCD model obtained by mechanical trauma by TE - HCEP . The corneal epithelial cells began to be transparent at the 12th day after the operation , the thickness of the corneal epithelium decreased , the thickness of the corneal epithelium decreased , the thickness of the corneal epithelium was reduced to the normal eye level for a long time , and the corneal epithelial cells were able to stay in a relatively transparent state for a long time .
Corneal epithelium transplantation was performed by using the LSCD model obtained by using TE - HCEP for corneal epithelium transplantation . The corneal thickness of corneal epithelium decreased significantly after operation . The corneal thickness of cornea epithelium was decreased significantly . The corneal epithelial cells were positive in cornea epithelium . There was a significant difference between epithelial cells . The results of corneal epithelium transplantation in New Zealand rabbits showed that the transplanted TE - HCEP formed a normal epithelium layer with a normal morphology , and the neovascularization was significantly reduced and the cornea was maintained in a transparent state for a long time .

Therefore , the TE - HCEP is expected to be used as a substitute for corneal epithelium to solve the serious deficiency of corneal donor material , which not only has important theoretical significance , but also can produce great social benefit and economic benefit .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R779.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 顧國(guó)貞;王芳;谷樹嚴(yán);周鴻雁;才子斌;石毅;叢登立;顏煒群;;以纖維蛋白為基質(zhì)網(wǎng)架的組織工程角膜上皮的構(gòu)建[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年05期

2 劉�？�,鐘世鎮(zhèn),曾靜,龔向明,葛堅(jiān);自體角膜緣移植治療兔單眼堿燒傷的實(shí)驗(yàn)研究[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年04期

3 劉燕霞;趙敏;;眼表組織工程種子細(xì)胞的來(lái)源及種植技術(shù)研究進(jìn)展[J];國(guó)際眼科雜志;2008年02期

4 閆濤;張明昌;;組織工程角膜支架材料再生絲素膜的生物相容性[J];國(guó)際眼科雜志;2008年08期

5 劉先寧;吳潔;朱秀萍;;角膜上皮干細(xì)胞缺失動(dòng)物模型的方法研究[J];國(guó)際眼科雜志;2009年08期

6 吳靜;角膜上皮的研究概況[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).眼科學(xué)分冊(cè);1997年04期

7 傅瑤,范先群,曹誼林;組織工程化角膜組織的研究新進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).眼科學(xué)分冊(cè);2001年02期

8 ;Establishment of an untransfected human corneal epithelial cell line and its biocompatibility with denuded amniotic membrane[J];International Journal of Ophthalmology(English Edition);2011年03期

9 楊志明,余希杰,黃富國(guó),解慧琪;外源性Ⅰ型膠原對(duì)人胚骨膜成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[J];華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2001年01期

10 丁勇,徐錦堂,陳建蘇,陳劍,吳春云,張志雄,周長(zhǎng)忍;兔角膜緣上皮細(xì)胞在體外殼聚糖共混膜上的培養(yǎng)及生物學(xué)鑒定[J];暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版);2005年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 趙君;組織工程人角膜內(nèi)皮的體外重建及其在兔角膜內(nèi)皮移植中的作用研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2010年

2 屈雷;組織工程化角膜上皮與內(nèi)皮的構(gòu)建和移植[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 楊洪收;人角膜上皮細(xì)胞系的鑒定與組織工程人角膜上皮體外重建的研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2010年

2 王馨;羊膜生物支架與組織工程化角膜上皮的構(gòu)建[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2004年

本文編號(hào)：1813086