本文選題：人角膜上皮種子細胞 + 去上皮層羊膜��； 參考：《中國海洋大學》2012年博士論文

【摘要】：人角膜上皮（Human Corneal Epithelium，HCEP）位于角膜最前端，由多層細胞構(gòu)成，其組織學結(jié)構(gòu)的完整性對于維持角膜的生理功能至關(guān)重要。人角膜上皮細胞（Human Corneal Epithelial Cell，HCEPC）是角膜抵御外來致病因子侵害的第一道重要防線，不僅能維持角膜的透明性，還能吸收氧氣和營養(yǎng)為角膜供氧/養(yǎng)。HCEP具有自我更新能力，其完整性和更新能力取決于位于角膜緣基底部的角膜緣干細胞（LimbalStem Cell，LSC）的不斷增殖與分化。眼球表面的燒傷、灼傷、嚴重機械創(chuàng)傷、病原體感染、角膜緣部位冷凍治療、接觸鏡的長期佩戴以及眼瘢痕性類天皰瘡等各種原因均可導致LSC損傷或功能障礙。角膜緣干細胞缺陷癥（Limbal Stem Cell Deficiency，LSCD）表現(xiàn)為LSC增殖能力喪失，導致持續(xù)性角膜上皮缺損、角膜緣屏障功能下降，致使結(jié)膜上皮侵入角膜、新生血管形成，進而影響角膜的光學特性，導致視力受損或致盲。在以前的眼表重建治療中，一般采用角膜上皮成形術(shù)以及自體或異體角膜緣移植的方法，但因供體角膜來源嚴重不足以及術(shù)后排斥反應(yīng)發(fā)生率較高，從而限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。近年來，角膜組織工程的興起為組織工程人角膜上皮（Tissue-engineered Human Corneal Epithelium，TE-HCEP）的體外重建以及患者通過臨床角膜上皮移植而重見光明帶來了希望。TE-HCEP體外重建的關(guān)鍵要素包括結(jié)構(gòu)功能正常的HCEPC種子細胞的大量獲得和生物相容性理想的載體支架的制備。在種子細胞方面，由于自體LSC來源與數(shù)量的限制，而連續(xù)性HCEPC細胞系因能提供出大量細胞故被認為是TE-HCEP規(guī)模化體外重建的種子細胞的有效來源。在業(yè)已建立的HCEPC細胞系中，癌基因轉(zhuǎn)染的永生化HCEPC細胞系因具有潛在的致瘤性無法作為種子細胞用于TE-HCEP的體外重建尤其是臨床移植，而非轉(zhuǎn)染HCEPC細胞系因能為理論研究和TE-HCEP提供出足量的正常細胞，故被認為是TE-HCEP種子細胞的理想來源。近年來，國內(nèi)學者成功建立了非轉(zhuǎn)染的連續(xù)性人角膜緣上皮細胞系，但至今仍未見其用于TE-HCEP體外重建的研究報道。在載體支架方面，羊膜（Amniotic Membrane，AM）作為一種天然高分子生物材料，為半透明且抗原性低的薄片組織，其基質(zhì)中含有大量的生長因子和蛋白酶抑制因子以及抗炎癥、抗成纖維化、抗菌、抗血管生成等的相關(guān)蛋白，與HCEPC具有理想的生物相容性并能促進HCEPC的細胞分化，已被廣泛應(yīng)用于眼表重建，因此被認為是TE-HCEP的理想載體支架之一。本文在本實驗室自主建立的非轉(zhuǎn)染HCEPC細胞系的基礎(chǔ)上，對此細胞系的屬性和致瘤性進行進一步鑒定，首次以該細胞為種子細胞建、以去上皮層羊膜（denuded AM，dAM）為載體支架，開展TE-HCEP的體外重建研究，并利用LSCD新西蘭兔模型對TE-HCEP在角膜上皮移植中的作用進行鑒定，旨在建立TE-HCEP體外重建的技術(shù)工藝條件，獲得可長期維持兔角膜透明的TE-HCEP，為TE-HCEP替代捐獻角膜用于角膜上皮異常疾病的臨床治療創(chuàng)造條件。 為了進一步鑒定非轉(zhuǎn)染HCEPC細胞系的屬性、功能蛋白的表達及潛在致瘤性，本文對第80代HCEPC進行了復蘇、擴增培養(yǎng)和鑒定。屬性檢測結(jié)果顯示，復蘇的第80代HCEPC透明度高，形態(tài)飽滿，呈圓形或卵圓形，鑲嵌排列呈鋪路狀，細胞群體倍增時間為40.75h，生長狀態(tài)良好，分裂旺盛，特征性染色體數(shù)目仍為2n=46。功能蛋白的表達檢測結(jié)果顯示，該細胞能夠表達HCEP特異性標志蛋白——角蛋白（keratin）3和12，以及緊密連接蛋白ZO-1、E-鈣粘蛋白、間隙連接蛋白-43、整聯(lián)蛋白β1，表明該細胞仍具有角膜上皮的表型，且具有形成完整HCEP結(jié)構(gòu)的潛能。致瘤性檢驗結(jié)果顯示，該細胞無致瘤性。因此，該細胞為TE-HCEP體外重建提供了種子細胞。 為了獲得TE-HCEP體外重建的理想載體支架，本文以新鮮AM為材料，采用胰酶倒置消化法對其進行去上皮層處理，再使用Ⅳ型膠原進行包被，并通過接種HCEPC研究dAM的生物相容性。通過光鏡、電鏡以及石蠟切片HE染色等方法對處理后的AM以及HCEPC在經(jīng)包被的dAM上的生長情況進行了觀察和鑒定，結(jié)果顯示利用胰酶于37℃倒置消化20min，再經(jīng)Ⅳ型膠原包被后獲得的dAM表面平整，無上皮細胞殘留，且有基底膜結(jié)構(gòu)；dAM對HCEPC具有理想的生物相容性，且光學性能良好。因此，dAM能夠作為理想的載體支架進行TE-HCEP的體外重建研究。 為了建立TE-HCEP體外規(guī)模化重建的技術(shù)工藝條件，本文以生長狀態(tài)良好的HCEPC為種子細胞，以dAM為載體支架，采用氣-液界面培養(yǎng)法體外重建TE-HCEP。利用石蠟切片HE染色、免疫組織化學檢測及電鏡觀察等方法對重建的TE-HCEP形態(tài)結(jié)構(gòu)、潛在功能等方面進行了鑒定。結(jié)果顯示TE-HCEP經(jīng)氣-液界面法培養(yǎng)5d后即可形成6~7層的復層結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)與正常HCEP結(jié)構(gòu)最為相近，且光學性能良好，表層的HCEPC平整呈卵圓形，且形成了豐富的微絨毛結(jié)構(gòu)。TE-HCEP仍具有HCEP屬性以及形成細胞間、細胞與dAM間連接的潛能，超微結(jié)構(gòu)與正常的角膜上皮層結(jié)構(gòu)相近。因此該方法能夠獲得理想的TE-HCEP，有望在將來進行規(guī)模化生產(chǎn)。 為了研究體外重建的TE-HCEP在新西蘭兔模型角膜上皮移植中的作用，本文利用DiI標記的第80代HCEPC在經(jīng)包被的dAM上進行體外重建。根據(jù)改良的三種方法分別制作了LSCD新西蘭兔模型，并利用TE-HCEP分別對其進行角膜上皮移植。利用角膜測厚、裂隙燈顯微鏡觀察、印跡細胞學檢查等方法跟蹤記錄了創(chuàng)傷以及移植后兔模型在體角膜的厚度、透明度、上皮完整性和新生血管情況；利用石蠟切片HE染色、免疫組織化學、電鏡觀察等方法進行TE-HCEP角膜上皮移植效果的離體檢測。結(jié)果顯示利用堿燒傷、機械創(chuàng)傷和聯(lián)合法均能獲得LSCD的新西蘭兔模型；利用TE-HCEP對堿燒傷的LSCD模型進行角膜上皮移植，，術(shù)后80d角膜仍為白瓷色，有新生血管；利用TE-HCEP對機械創(chuàng)傷獲得的LSCD模型進行角膜上皮移植，術(shù)后第12d角膜開始透明，厚度明顯下降，新生血管減少，第25d角膜厚度恢復到正常眼水平，且能夠長時間保持較透明狀態(tài)。術(shù)后120d的離體檢測結(jié)果顯示角膜上皮細胞來源于體外重建的TE-HCEP，約4~5層，角蛋白3表達呈陽性，上皮細胞之間存在緊密連接結(jié)構(gòu)，與對照組存在顯著性差異；利用TE-HCEP對聯(lián)合法獲得的LSCD模型進行角膜上皮移植，術(shù)后第12d角膜厚度明顯下降，第49d角膜新生血管明顯減少，第70d角膜厚度恢復到正常眼水平，角膜長時間保持較透明狀態(tài)。術(shù)后147d的離體檢測結(jié)果顯示角膜上皮細胞來源于TE-HCEP，約3~4層，角蛋白3表達呈陽性，上皮細胞之間存在緊密連接結(jié)構(gòu)并有基底膜結(jié)構(gòu)，與對照組存在顯著性差異。新西蘭兔角膜上皮移植實驗的結(jié)果表明，所移植TE-HCEP形成了形態(tài)結(jié)構(gòu)較正常的角膜上皮層，新生血管明顯減少，并能夠使角膜長時間保持較透明狀態(tài)。 綜上所述，本文首次以非轉(zhuǎn)染、無致瘤性的第80代HCEPC為種子細胞，以dAM為載體支架，體外重建出了形態(tài)結(jié)構(gòu)和潛在功能與正常HCEP相近的TE-HCEP，其移植后能夠長時間保持LSCD兔角膜較透明狀態(tài)。因此，該TE-HCEP有望作為角膜上皮的替代物從根本上解決角膜供體材料嚴重不足的現(xiàn)狀，為角膜上皮異常疾病的患者帶來重見光明的希望，這不僅具有重要的理論意義，而且能產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。
[Abstract]:Human corneal epithelial cells ( HCEP ) have been used in vitro reconstruction of corneal epithelium ( TE - HCEP ) . Amniotic Membrane ( AM ) is a kind of natural high molecular biological material , which is a semi - transparent and low - antigenicity thin - sheet tissue . It contains a large amount of growth factor and protease inhibitor , as well as anti - inflammation , anti - fibrosis , antibacterial , anti - angiogenesis and other related proteins . It has been widely used in vitro reconstruction of TE - HCEP . The aim of this paper is to establish the TE - HCEP in vitro reconstruction of TE - HCEP .

In order to further identify the properties of non - transfected HCEPC cell lines , the expression of functional protein and the potential oncogenicity of HCEPC cell lines were studied .

In order to obtain the ideal carrier scaffold for the in vitro reconstruction of TE - HCEP , the growth of AM and HCEPC was investigated and identified by trypan inverted digestion with fresh AM as material . The results showed that the growth of AM and HCEPC was studied by light microscope , electron microscope and paraffin section HE staining .
dAM has ideal biocompatibility and good optical performance for HCEPC . Therefore , dAM can be used as an ideal carrier for in vitro reconstruction of TE - HCEP .

In order to establish the technological process conditions for the in vitro large - scale reconstruction of TE - HCEP , the recombinant TE - HCEP was reconstructed in vitro by using HCEPC as seed cell and dAM as carrier . The results showed that the structure of TE - HCEP was similar to normal HCEP structure , and its structure was similar to that of normal HCEP structure . The structure of TE - HCEP was similar to normal HCEP structure .

In order to study the role of TE - HCEP reconstructed in vitro in rabbit model corneal epithelium transplantation in New Zealand , a novel rabbit model of LSCD New Zealand rabbit model was constructed by using DiI - labeled 80 - generation HCEPC in vitro . The corneal epithelium transplantation was performed by using TE - HCEP .
The ex vivo detection of TE - HCEP corneal epithelium transplantation was carried out by means of HE staining , immunohistochemistry and electron microscopy . The results showed that the new Zealand rabbit model with LSCD was obtained by alkali burn , mechanical trauma and combined method .
The corneal epithelium transplantation was performed on the LSCD model of alkali burn by TE - HCEP .
The corneal epithelium transplantation was performed on the LSCD model obtained by mechanical trauma by TE - HCEP . The corneal epithelial cells began to be transparent at the 12th day after the operation , the thickness of the corneal epithelium decreased , the thickness of the corneal epithelium decreased , the thickness of the corneal epithelium was reduced to the normal eye level for a long time , and the corneal epithelial cells were able to stay in a relatively transparent state for a long time .
Corneal epithelium transplantation was performed by using the LSCD model obtained by using TE - HCEP for corneal epithelium transplantation . The corneal thickness of corneal epithelium decreased significantly after operation . The corneal thickness of cornea epithelium was decreased significantly . The corneal epithelial cells were positive in cornea epithelium . There was a significant difference between epithelial cells . The results of corneal epithelium transplantation in New Zealand rabbits showed that the transplanted TE - HCEP formed a normal epithelium layer with a normal morphology , and the neovascularization was significantly reduced and the cornea was maintained in a transparent state for a long time .

Therefore , the TE - HCEP is expected to be used as a substitute for corneal epithelium to solve the serious deficiency of corneal donor material , which not only has important theoretical significance , but also can produce great social benefit and economic benefit .

【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R779.65

【參考文獻】

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6 吳靜;角膜上皮的研究概況[J];國外醫(yī)學.眼科學分冊;1997年04期

7 傅瑤,范先群,曹誼林;組織工程化角膜組織的研究新進展[J];國外醫(yī)學.眼科學分冊;2001年02期

8 ;Establishment of an untransfected human corneal epithelial cell line and its biocompatibility with denuded amniotic membrane[J];International Journal of Ophthalmology(English Edition);2011年03期

9 楊志明,余希杰,黃富國,解慧琪;外源性Ⅰ型膠原對人胚骨膜成骨細胞生物學特性的影響[J];華西醫(yī)科大學學報;2001年01期

10 丁勇,徐錦堂,陳建蘇,陳劍,吳春云,張志雄,周長忍;兔角膜緣上皮細胞在體外殼聚糖共混膜上的培養(yǎng)及生物學鑒定[J];暨南大學學報(自然科學與醫(yī)學版);2005年02期

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本文編號：1813086