發(fā)布時間：2018-04-26 19:17

  本文選題：LSCC + miR-24��； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：【背景】頭頸部惡性腫瘤中以喉癌最為常見,其病理類型又以鱗狀細(xì)胞癌最多,所占比例高達(dá)90%[1]。近年來喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngalsquamouscell carcinoma,LSCC)在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。LSCC病因復(fù)雜,現(xiàn)有觀點認(rèn)為與吸煙、飲酒、空氣污染、乳頭狀瘤病毒感染等有關(guān)。喉部結(jié)構(gòu)隱蔽且復(fù)雜,很多LSCC患者發(fā)現(xiàn)時已處于相對晚期,導(dǎo)致其長期生存率較低。LSCC的治療主要應(yīng)用外科手術(shù)切除和保留喉的放化療,外科手術(shù)雖最為有效但常造成大范圍的組織缺損和器官損傷,導(dǎo)致功能重建困難或無法修復(fù)重建,最終患者不得不承受相應(yīng)功能遭到破壞甚至完全喪失的后果,嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。放化療雖然避免了手術(shù)切除造成的器官或組織缺損,具有保全結(jié)構(gòu)和功能方面的優(yōu)勢,但也存在許多局部及全身并發(fā)癥問題,其中最重要的是容易出現(xiàn)放療和化療抵抗導(dǎo)致病情得不到有效控制,從而不能延長患者的生存時間。因此尋找新的診斷方法及治療靶點對提高LSCC診治率有重要意義�，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是一個多基因、多因素參與的復(fù)雜過程,分子水平的改變在腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展過程中起到了重要調(diào)控作用,且這種變化往往是早于臨床表現(xiàn)出現(xiàn)之前就已發(fā)生。對LSCC發(fā)生和進(jìn)展的分子調(diào)節(jié)機制進(jìn)行進(jìn)一步研究,找尋其中發(fā)揮關(guān)鍵作用的分子,一方面能夠為LSCC早期診斷和預(yù)后判斷提供可用的標(biāo)記分子,另一方面也能夠為針對LSCC進(jìn)行分子靶向干預(yù)治療提供潛在的藥物靶點。MicroRNAs(miRNAs)是一組由17-25個核苷酸組成的小非編碼RNA,它通過與目標(biāo)信使RNA(messenger RNA,mRNA)的3’端非翻譯區(qū)(3'untranslational region,3’-UTR)特異性結(jié)合降解轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物或抑制翻譯過程,與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),是腫瘤發(fā)展與維持過程中的重要因子[2]。多種miRNA被報道能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷徙、凋亡及放化療抵抗,且在相關(guān)腫瘤的早期診斷、治療和預(yù)后方面具有良好前景,這其中就包括有miR-24,它在肺癌、肝細(xì)胞癌及口腔癌等多種實體腫瘤中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,有成為腫瘤標(biāo)記物的潛力[3][4,5]。X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)是凋亡相關(guān)蛋白家族最具活力分子,它通過抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展,目前研究表明它在喉癌中高表達(dá)且發(fā)揮促癌作用。目前關(guān)于miR-24與LSCC的研究較少,有研究報道指出miR-24在LSCC組織中表達(dá)低于癌旁組織,提示miR-24可能與LSCC發(fā)生發(fā)展相關(guān),但是其具體表達(dá)模式及作用機制尚不完全清晰,與XIAP是否相關(guān),以及對LSCC的放療影響目前也未見相關(guān)報道。我們前期選擇15組LSCC組織和癌旁組織檢測miR-24,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-24在LSCC組織中低表達(dá),支持了本研究的可行性。為闡述miR-24在LSCC中的作用,在本研究中我們檢測了miR-24在LSCC中表達(dá)水平并分析了其與患者臨床病理特征的相關(guān)性;在LSCC細(xì)胞系中檢測了miR-24對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為影響;對其作用的靶基因進(jìn)行預(yù)測和驗證;驗證靶基因沉默后LSCC細(xì)胞的生物學(xué)行為改變;還進(jìn)一步探索了miR-24對LSCC細(xì)胞放療敏感性的影響及其可能機制,以期為miR-24用于LSCC的診斷、治療和預(yù)后判斷提供理論依據(jù)�！灸康摹�1.檢測人LSCC細(xì)胞和組織中miR-24的表達(dá),并分析其表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性。2.檢測miR-24對LSCC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響。3.預(yù)測miR-24的靶基因并對其進(jìn)行驗證。4.驗證沉默靶基因后LSCC細(xì)胞的生物學(xué)行為改變。5.研究miR-24對LSCC細(xì)胞放療敏感性影響及其可能的發(fā)生機制�！痉椒ā�1.利用qRT-PCR檢測Hep-2細(xì)胞、AMC-HN-8細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞中miR-24表達(dá);收集60例LSCC患者的腫瘤組織和配對癌旁組織,之后利用q RT-PCR檢測其中miR-24表達(dá)并分析其表達(dá)水平與臨床病理特征之間的相關(guān)性。2.利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)miR-24的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞,同時設(shè)置空白對照組和陰性對照組。MTT、克隆形成實驗檢測Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞的增殖和克隆形成變化;劃痕實驗和Transewell實驗對其遷移和侵襲能力進(jìn)行檢測;流式細(xì)胞術(shù)分析其凋亡變化。3.利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測miR-24的靶基因并從中篩選目標(biāo)靶基因,通過雙熒光素酶基因檢測系統(tǒng)對靶基因進(jìn)行驗證。Western blotting檢測過表達(dá)miR-24組和對照組Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞中靶基因蛋白表達(dá)水平;qRT-PCR、Western blotting分別檢測Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞和LSCC組織中靶基因表達(dá),并分析LSCC組織中靶基因mRNA與miR-24的相關(guān)性。4.利用RNA干擾技術(shù)將Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞中miR-24的靶基因沉默,同時設(shè)置空白對照組和陰性對照組,Western blotting檢測沉默效果。通過MTT、細(xì)胞克隆形成實驗、流式細(xì)胞術(shù)對其增殖、凋亡進(jìn)行檢測,驗證干擾靶基因后是否產(chǎn)生與上調(diào)miR-24相似的作用。5.利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得過表達(dá)miR-24的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞,同時設(shè)置對照組。對過表達(dá)miR-24的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞與對照組細(xì)胞分別進(jìn)行0、2、4、6、8Gy的射線照射,通過Clonogenic survival assay檢測接受不同劑量照射后的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞存活率;給予過表達(dá)miR-24的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞與對照組細(xì)胞6Gy射線照射,計算并分析各組細(xì)胞的克隆形成數(shù);流式細(xì)胞術(shù)分析接受6Gy照射后的各組細(xì)胞凋亡率;Western blotting檢測接受6Gy照射后的各組細(xì)胞中cleaved-caspase-3、總caspase-3、cleaved-PARP、總PARP表達(dá)。6.利用RNA干擾技術(shù)沉默Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞中miR-24的靶基因,設(shè)置對照組比對。所有細(xì)胞均接受0、2、4、6、8Gy的射線照射,Clonogenic survival assay分析不同劑量照射后Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞存活率;沉默組和對照組細(xì)胞分別進(jìn)行6Gy射線照射,流式細(xì)胞術(shù)觀察各組細(xì)胞凋亡率。Western blotting檢測接受6Gy照射后的各組細(xì)胞中cleaved-caspase-3、總caspase-3、cleaved-PARP、總PARP表達(dá)�！窘Y(jié)果】1.Hep-2細(xì)胞、AMC-HN-8細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞相比較miR-24表達(dá)下調(diào)。2.LSCC組織較癌旁組織中的miR-24表達(dá)水平下調(diào),LSCC患者腫瘤組織中miR-24的表達(dá)水平與患者的TNM分期(P=0.014)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.019)呈現(xiàn)相關(guān),而與年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤分型及病理學(xué)分級無相關(guān)性。3.利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞中miR-24,qRT-PCR檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)入miR-24的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞與空白轉(zhuǎn)入組及未轉(zhuǎn)染陰性對照組相比較miR-24明顯升高,空白轉(zhuǎn)入組與未轉(zhuǎn)染陰性對照組無變化,表明過表達(dá)miR-24的LSCC細(xì)胞系構(gòu)建成功。4.MTT、克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-24的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞與對照組相比較增殖受到抑制,且過表達(dá)miR-24組較對照組的克隆形成數(shù)少,細(xì)胞形狀小;劃痕實驗及Transewell結(jié)果表明過表達(dá)miR-24的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞遷移侵襲能力降低;流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-24的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞凋亡率升高,以上結(jié)果表明過表達(dá)miR-24可抑制LSCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,并促進(jìn)其凋亡。5.利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測miR-24的靶基因,從中選中XIAP為目標(biāo)靶基因,雙熒光素酶基因檢測系統(tǒng)對XIAP進(jìn)行驗證,結(jié)果顯示與空白對照組(轉(zhuǎn)入miR-NC)比較miR-24可抑制自然型XIAP 3’UTR報告載體的熒光信號,但是對突變型載體來說無論共轉(zhuǎn)染miR-24還是miR-NC其熒光活性基本無明顯改變,表明miR-24能直接與XIAP 3’UTR結(jié)合,XIAP是miR-24的下游靶基因。6.Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-24的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞與空白對照組比較,XIAP表達(dá)明顯下調(diào),表明miR-24可負(fù)性調(diào)控XIAP表達(dá)。7.qRT-PCR、Western blotting檢測結(jié)果顯示與正常HaCaT細(xì)胞相比較,Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞中XIAPmRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào);LSCC組織中XIAP表達(dá)水平較鄰近組織明顯上調(diào),對LSCC組織中miR-24表達(dá)量與XIAP mRNA表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果表明兩者呈負(fù)性相關(guān)。8.利用基因干擾技術(shù)將Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞中miR-24的靶基因XIAP沉默,Western blotting結(jié)果顯示沉默組較未沉默組的XIAP表達(dá)水平明顯下降,未沉默組與未干擾對照組相比較無變化,表明干擾成功。9.MTT、細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果表明沉默XIAP的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞較未沉默對照組細(xì)胞生長受到抑制、克隆數(shù)減少;流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)沉默XIAP的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞凋亡率較對照組高。10.Clonogenic survival assay結(jié)果顯示:(1)接受不同劑量射線照射(2、4、6、8Gy)的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞(不管是轉(zhuǎn)入miR-24或轉(zhuǎn)入miR-NC)存活率均較未接受照射組低,且在0-8Gy范圍內(nèi)下降程度隨劑量增加而增大;(2)與轉(zhuǎn)入miR-NC的對照組相比較,過表達(dá)miR-24的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞在每個劑量組存活率均降低明顯,說明輻射可降低Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞存活率,且隨劑量增加細(xì)胞存活數(shù)量越少,過表達(dá)miR-24可使細(xì)胞死亡進(jìn)一步增多。11.輻射后克隆形成實驗顯示:(1)轉(zhuǎn)入miR-24和轉(zhuǎn)入miR-NC的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞接受6Gy照射后克隆形成數(shù)均較未接受輻射組少;(2)同一劑量(6Gy)照射后,過表達(dá)miR-24的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞較空白轉(zhuǎn)入對照組細(xì)胞克隆數(shù)少,說明輻射可抑制Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞增殖,過表達(dá)miR-24可使抑制進(jìn)一步增強。12.輻射后流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示:(1)接受6Gy射線照射后細(xì)胞凋亡率均較未照射組高(轉(zhuǎn)入miR-24或轉(zhuǎn)入miR-NC的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞均如此);(2)轉(zhuǎn)入miR-24的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞均較空白轉(zhuǎn)入組凋亡率高,說明miR-24可通過增強輻射誘導(dǎo)的凋亡,增加Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞放療敏感性。13.Western blotting分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)不論有沒有過表達(dá)miR-24,與相對應(yīng)未照射組比較,接受6Gy照射的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞cleaved-caspase-3和cleaved-PARP均增多,總caspase-3和總PARP表達(dá)均減少;(2)轉(zhuǎn)入miR-24的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞均較空白轉(zhuǎn)入組cleaved-caspase-3和cleaved-PARP增多,且總caspase-3和總PARP表達(dá)減少,表明輻射可增加caspase-3活性,過表達(dá)miR-24可使caspase-3活性進(jìn)一步增強,miR-24可通過誘導(dǎo)caspase-3依賴的細(xì)胞凋亡增強LSCC細(xì)胞的放療敏感性。14.對沉默XIAP的Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞給予與過表達(dá)miR-24的細(xì)胞同樣的射線干預(yù)實驗,結(jié)果表明沉默XIAP同樣可以通過增強輻射誘導(dǎo)的caspase-3依賴的細(xì)胞凋亡增強Hep-2、AMC-HN-8細(xì)胞放療敏感性�！窘Y(jié)論】1.miR-24在LSCC細(xì)胞和組織中均低表達(dá),miR-24在組織中的表達(dá)水平與患者的TNM臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。2.miR-24能抑制LSCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力,并促進(jìn)其凋亡。3.XIAP是miR-24的直接下游靶基因;沉默XIAP能抑制LSCC細(xì)胞增殖,并促進(jìn)其凋亡;LSCC細(xì)胞和組織中XIAP在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均高表達(dá),且在LSCC組織中XIAPmRNA與miR-24負(fù)性相關(guān)。4.輻射可降低LSCC細(xì)胞存活率,抑制其克隆形成,并促進(jìn)其凋亡。miR-24能通過增加輻射誘導(dǎo)的caspase-3依賴的細(xì)胞凋亡增強LSCC細(xì)胞放療敏感性。沉默XIAP可通過與上調(diào)miR-24同樣機制增強LSCC細(xì)胞放療敏感性。綜上所述,miR-24在LSCC中低表達(dá),miR-24的表達(dá)水平與LSCC患者的疾病進(jìn)展密切相關(guān)。miR-24能抑制LSCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,促進(jìn)LSCC凋亡,增加LSCC細(xì)胞放療敏感性,其功能極有可能是通過靶向作用于XIAP實現(xiàn)的。miR-24有成為LSCC診斷和預(yù)后有效標(biāo)記物的潛力,開發(fā)針對miR-24的藥物并與放療聯(lián)合使用可有望成為提高LSCC患者療效的有效方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.65
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本文編號：1807318