本文選題：喉鱗狀細胞癌 + 免疫熒光染色��； 參考：《復(fù)旦大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：第一部分人喉鱗狀細胞癌中BMI1基因的檢測 目的探討人喉鱗狀細胞癌標(biāo)本中BMI1基因的表達情況及BMI1基因的表達與喉癌的臨床分期與分型之間的關(guān)系。 方法收集人喉鱗狀細胞癌腫瘤標(biāo)本和癌旁組織,免疫熒光染色法定性檢測BMI1基因在喉癌標(biāo)本中的表達情況,Real-time PCR和Western Blot從分子水平和蛋白水平定量比較BMI1基因在喉癌標(biāo)本與正常癌旁組織中的表達情況,以及BMI1的表達情況與臨床分期與分型之間的關(guān)系。 結(jié)果取得20例喉鱗狀細胞癌標(biāo)本和20例正常癌旁組織標(biāo)本。其中1-2期喉癌標(biāo)本6例,3-4期標(biāo)本14例；聲門型標(biāo)本4例,聲門上型標(biāo)本16例。腫瘤組織進行BMI1基因免疫熒光染色觀察可見BMI1基因普遍表達。Real-time PCR結(jié)果顯示BMI1在腫瘤標(biāo)本中的表達明顯高于癌旁組織(p0.01),其中3-4期腫瘤中的表達約為1-2期腫瘤中的2倍(p0.01),但是聲門型與聲門上型中BMI1表達的比較不具有顯著差異。Western Blot的結(jié)果也與Real-time PCR的結(jié)果一致。 結(jié)論BMI1在喉鱗狀細胞癌中顯著表達,其表達程度與腫瘤的臨床分期有關(guān),但是與腫瘤的分型無明顯關(guān)系。 第二部分BMI1基因?qū)τ谌撕戆〩ep-2細胞系的作用 目的將Hep-2細胞與RNA干擾細胞進行比較,研究BMI1基因?qū)τ谌撕戆〩ep-2細胞系的作用。 方法構(gòu)建慢病毒載體,shRNA干擾使喉癌Hep-2細胞系的BMI1基因表達下調(diào)。正常培養(yǎng)Hep-2細胞和RNAi細胞于96孔板上,在1、3、5、7天觀察生長狀態(tài)并用CCK-8法測定細胞的增殖狀態(tài)。用有限稀釋法將培養(yǎng)在96孔板中的兩種細胞制成單個細胞懸液并培養(yǎng)2周,觀察克隆形成能力并與固定測量框比較計算面積比。將Hep-2細胞與RNAi細胞培養(yǎng)后用TUNEL和FITC-Annexin V染色,比較細胞凋亡能力。PI染色后用流式細胞儀比較兩種細胞的周期分布情況。兩種細胞培養(yǎng)后接受劑量為2Gy、4Gy和8Gy的X射線放療,48小時后以CCK-8法測吸光度值并計算抑制率,比較對放療的耐受性。兩種細胞中加入3μg/mL,6μg/mL和12μ g/mL的順鉑注射液,培養(yǎng)24小時后以CCK-8法比較對化療的耐受性。將1×105的Hep-2和RNAi細胞分別注入10只NOD/SCID小鼠的腋窩皮下,8周后觀察成瘤情況,比較兩組細胞的致瘤能力。 結(jié)果shRNA干擾使BMI1表達下調(diào),干擾效率為83.75%。Hep-2細胞和RNAi細胞培養(yǎng)1周后測吸光度值,可見從第三天起RNAi細胞的吸光度明顯低于Hep-2細胞,并且有停止生長趨勢。單個Hep-2和RNAi細胞在96孔板中培養(yǎng)2周后觀察并用固定測量框比較面積比,可見RNAi細胞形成細胞球體積顯著減小,面積比也降低(p0.01)。兩組細胞用TUNEL染色后觀察可見RNAi細胞呈現(xiàn)較強的凋亡能力,FITC-Annexin V染色后用流式細胞儀分析結(jié)果也表明RNAi細胞更容易發(fā)生凋亡(p0.01)。PI染色后用流式細胞儀檢測兩組細胞的周期分布,結(jié)果顯示RNAi細胞處于G0/G1期的細胞比例顯著增高,S期和G2/M期的比例都顯著降低。經(jīng)2Gy、4Gy和8Gy的放療后RNAi細胞對放療的抑制性顯著增加。經(jīng)3μg/mL,6μg/mL和12μ g/mL的順鉑化療后結(jié)果顯示隨著劑量的增加,RNAi細胞的抑制率在各個劑量都比Hep-2高。體內(nèi)成瘤實驗結(jié)果顯示RNAi組形成的腫瘤體積明顯減小,重量減輕(p0.01)。 結(jié)論BMI1沉默能夠抑制Hep-2細胞的增殖能力,促進期凋亡,促使細胞在G0/G1期聚集,減少對放化療的耐受性,并且能夠抑制體內(nèi)成瘤能力。 第三部分人喉癌Hep-2細胞系腫瘤干細胞中BMI1基因的檢測 目的探討B(tài)MIl與CD133在喉癌標(biāo)本中的共同表達情況以及BMI1在CD133+喉癌干細胞中的表達情況。 方法BMI1與CD133在喉癌標(biāo)本中進行免疫熒光染色,熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察。流式細胞儀檢測喉癌Hep-2細胞與RNAi細胞中CD133+細胞率并進行分選。培養(yǎng)觀察分選后的細胞,Real-time PCR定量檢測兩組細胞中CD133的相對表達量,以及干細胞基因Notch2和PTEN的相對表達量。 結(jié)果BMI1和CD133在喉癌標(biāo)本中共同表達,其中CD133在細胞膜上表達,BMIl主要在CD133+細胞的細胞核中。Real-time PCR結(jié)果顯示BMI1在CD133+細胞中的表達量顯著高于CD133-細胞(p0.01),而Notch2和PTEN在CD133+和CD133-細胞中的表達量沒有統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論BMI1與CD133在喉鱗狀細胞癌中共同表達,并且BMI1主要表達于CD133+喉癌干細胞中對其發(fā)揮作用。Notch2和PTEN對于CD133+喉癌干細胞沒有特異性作用。 第四部分BMI1基因?qū)τ谌撕戆〩ep-2細胞系腫瘤干細胞的作用 目的探討B(tài)MI1基因?qū)τ贑D133+喉癌干細胞的作用以及對于相關(guān)基因和信號通路的影響。 方法流式細胞儀檢測Hep-2細胞和RNAi細胞中CD133+喉癌干細胞的含量并分選。培養(yǎng)分選后的CD133+干細胞,比較成球能力。Real-time PCR檢測Hep-2和RNAi細胞中CD133的相對表達量以及BMI1相關(guān)基因p53、p16和cyclinD1的表達量,分析對信號通路的影響。 結(jié)果流式細胞儀檢測結(jié)果顯示RNAi細胞中CD133+細胞的含量明顯比Hep-2細胞少(p0.01)。分選后細胞培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)Hep2-CD133+細胞的生長速度和成球能力明顯比RNAi-CD133+細胞強。Real-time PCR結(jié)果顯示RNAi細胞中CD133的表達量顯著減少(p0.01),同時在RNAi細胞中,p53、p16的表達量顯著增加(p0.05),cyclinD1的表達量顯著減少(p0.01)。 結(jié)論BMI1沉默導(dǎo)致了CD133+喉癌干細胞的減少,從而抑制了腫瘤細胞的增殖、促進其凋亡并且減弱了對放化療的耐受性,同時BMI1對INK4A/ARF/P53信號通路的調(diào)控發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R739.65

【共引文獻】

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