本文選題：原代人晶體上皮細胞　切入點：白內(nèi)障　出處：《復旦大學》2012年博士論文

【摘要】：年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract, ARC)為全球致盲眼病的主要原因。在我國約有250萬人因白內(nèi)障致盲,占全球白內(nèi)障致盲總數(shù)的10%。隨著人口的老齡化,預計我國每年新增白內(nèi)障患者將超過100萬,而我國的白內(nèi)障年手術(shù)量尚不足以解決每年的新增例數(shù)。因此,我國的白內(nèi)障盲防治問題十分嚴峻。而先天性白內(nèi)障是指出生前即存在,或出生后才逐漸形成的先天遺傳或發(fā)育障礙的白內(nèi)障,超過1/3的患者是遺傳所致。任何參與、影響晶狀體發(fā)育的基因突變都可能導致先天性白內(nèi)障的發(fā)生。因此,明確先天性白內(nèi)障的發(fā)病機制對于治療及預防先天性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展具有重要的意義。白內(nèi)障摘除聯(lián)合人工晶狀體(intraocular lens, IOL)植入是目前治療白內(nèi)障最常用且效果較為理想的方法,而后囊膜混濁(posterior capsular opacification, PCO)是影響病人術(shù)后遠期視力預后的最常見的并發(fā)癥,其術(shù)后5年的發(fā)生率高達30%左右。雖然可以利用激光或者手術(shù)切開混濁的后囊膜,但是卻增加了病人的經(jīng)濟負擔,并會帶來新的并發(fā)癥。所以如何預防PCO的發(fā)生是眼科醫(yī)生和病人都比較關(guān)注的一個問題。 體細胞誘導成為多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的研究成果被國際生命科學界譽為具有里程碑意義的創(chuàng)新之舉。多能干細胞能夠自我更新,能在體內(nèi)外分化成幾乎所有類型的細胞,在再生醫(yī)學等方面有巨大的應用潛力,具有極高的理論研究價值。通常用來源于囊胚期胚胎的內(nèi)細胞團的胚胎干細胞、通過核移植得到的胚胎干細胞以及在成體細胞中轉(zhuǎn)入外源轉(zhuǎn)錄因子得到的iPSCs,進行體細胞重編程研究。在短短數(shù)年的時間里,此項研究已經(jīng)在細胞重編程的機理研究、探索疾病的發(fā)生發(fā)展機制以及臨床醫(yī)學的應用等領(lǐng)域引發(fā)了很多突破性的進展；而且這一非克隆干細胞技術(shù)的誕生,成功地避開了長期以來爭論不休的倫理問題,極大地推動該領(lǐng)域和相關(guān)科學領(lǐng)域的發(fā)展。與胚胎干細胞研究相比,體細胞重編程技術(shù)可以為更多的患者提供特異性多能干細胞。因而,在醫(yī)學應用方面(例如器官培養(yǎng)和器官移植等)有廣闊的前景。 患者特異性的多能干細胞的建立能夠為疾病發(fā)病機制的研究、治療藥物的篩選及細胞移植治療提供有力的工具。采用慢病毒載體將外源性轉(zhuǎn)錄因子導入白內(nèi)障患者晶體上皮細胞,從而獲得誘導性多能干細胞。白內(nèi)障患者來源的多能干細胞的建立,能夠為晶體發(fā)育、細胞分化、衰老提供便利的細胞模型,同時可為白內(nèi)障治療藥物的篩選及白內(nèi)障發(fā)病機制的研究提供有力的研究工具。 第一部分原代人晶體上皮細胞的體外培養(yǎng) 目的對正常人晶體、年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶體上皮細胞及人皮膚成纖維細胞進行體外培養(yǎng),并觀察體外培養(yǎng)的晶體上皮細胞及皮膚成纖維細胞的生物學特性及組織學變化。 方法正常人晶體上皮細胞培養(yǎng)取材于角膜移植術(shù)后供體眼的晶狀體囊膜,年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶體上皮細胞培養(yǎng)取材于白內(nèi)障超乳手術(shù)中撕除的晶體前囊膜。角膜移植術(shù)后供體眼的晶狀體沿赤道部后方約2mm環(huán)形剪開后囊膜,小心取下完整的前囊膜和赤道部囊膜,剪成1mm×1mm大小的組織塊,利用組織塊貼片法,進行原代人晶狀體上皮細胞的培養(yǎng)。白內(nèi)障晶體前囊膜在超乳手術(shù)中完整取材、洗去粘彈劑之后剪成1mm×1mm大小的組織塊,利用組織塊貼片法進行培養(yǎng)。使用0.25%胰酶溶液對融合后的細胞進行消化傳代。取年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的皮膚組織,剪成1mm3大小的組織塊,過夜消化,離心收集細胞,經(jīng)多次傳代后,獲得較為純化的皮膚成纖維細胞進行培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡下對三種細胞進行形態(tài)學觀察。采用CCK-8法連續(xù)7天測定三種細胞的增殖速率,繪制生長曲線并進行比較。 結(jié)果正常人晶體囊膜組織塊貼壁48～72小時后可見人晶狀體上皮細胞從組織塊邊緣長出,約10～15天達到融合。初期正常人晶體上皮細胞為多角形,胞體透亮,細胞邊界清晰。融合后的細胞具有上皮細胞的形態(tài)特征,為典型的六角形或多邊形。在體外細胞可傳五代,但第三代以后細胞表型向成纖維細胞轉(zhuǎn)化。第三代以后正常人晶體上皮細胞胞體呈梭形或長條形。第五代正常人晶體上皮細胞老化,胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡樣改變,最后崩解死亡。白內(nèi)障患者晶體上皮細胞形態(tài)與增殖能力與正常晶體上皮細胞相類似,但部分白內(nèi)障晶體上皮細胞與正常人晶體上皮細胞形態(tài)差異較大,更接近成纖維細胞,且細胞在第一次傳代后即老化崩解。人皮膚成纖維細胞伸展呈梭形或多邊形,在經(jīng)過多次培養(yǎng)傳代后,可得到較為純化的成纖維細胞。CCK-8法繪制的生長曲線表明人皮膚成纖維細胞具有最高的增殖速率,白內(nèi)障患者的晶體上皮細胞增殖最慢。 結(jié)論利用組織塊貼片法進行人晶狀體上皮細胞培養(yǎng),操作簡單,成功率高。第二代人晶狀體上皮細胞是進行細胞學及相關(guān)研究比較理想的實驗對象。正常人晶體上皮細胞具有較好的生長及增殖能力,而白內(nèi)障晶體上皮細胞增殖力差、細胞形態(tài)不佳。人皮膚成纖維細胞在消化離心后經(jīng)過多次傳代能夠獲得純化的成纖維細胞。人皮膚成纖維細胞增殖最快,正常人晶體上皮細胞增殖速率居中,白內(nèi)障患者晶體上皮細胞增殖速率最慢。 第二部分白內(nèi)障患者誘導性多能干細胞的建立 目的分別構(gòu)建表達OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒載體(Lentivirus),并轉(zhuǎn)染年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者體外培養(yǎng)的晶體上皮細胞,誘導建立患者來源的誘導性多能干細胞,與同一患者來源的皮膚成纖維細胞對比,觀察限定因子對于誘導多能干細胞的誘導效率。 方法選擇3例診斷為年齡相關(guān)性白內(nèi)障的患者,取其晶體前囊膜及皮膚組織進行體外培養(yǎng)。白內(nèi)障晶體前囊膜在超乳手術(shù)中完整取材、洗去粘彈劑之后剪成lmm×lmm大小的組織塊,利用組織塊貼片法進行培養(yǎng)。使用0.25%胰酶溶液對融合后的細胞進行消化傳代。取上述3例年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的皮膚組織,剪成Imm3大小的組織塊,過夜消化,離心收集細胞,經(jīng)傳代后,獲得較為純化的皮膚成纖維細胞進行培養(yǎng)。分別將含有OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒載體質(zhì)粒(plenti-hOCT4/plenti-hSOX2/plenti-hKLF4)同輔助質(zhì)粒(pCMV-gag-pol-PA/pCMV-VSVg)一起共感染293T細胞,重組包裝構(gòu)建慢病毒載體(分別為Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4).將構(gòu)建的三種慢病毒載體混合分別感染第2代的白內(nèi)障晶體上皮細胞和人皮膚成纖維細胞,培養(yǎng)5天后,與小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)進行共培養(yǎng),直至出現(xiàn)iPSCs。采用堿性磷酸酶(ilkaline phosphatase, AKP)染色比較白內(nèi)障晶體上皮細胞和人皮膚成纖維細胞誘導生成iPSCs的效率差異。同時培養(yǎng)人H9胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)進行對照。 結(jié)果利用組織塊貼片法培養(yǎng)的白內(nèi)障患者晶體上皮細胞及消化法培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞形態(tài)與增殖能力較好,第2代細胞適用于進行慢病毒感染。構(gòu)建的慢病毒載體enti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4能高效轉(zhuǎn)染兩種細胞,并不影響細胞的狀態(tài)及增殖能力。在慢病毒載體轉(zhuǎn)染后第5天,將白內(nèi)障晶體上皮細胞和人皮膚成纖維細胞分別與MEFs進行共培養(yǎng),在轉(zhuǎn)染后第12天開始出現(xiàn)與ESCs形態(tài)相似的細胞克隆。細胞克隆堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)染色陽性,說明已成功誘導出iPSCs。采用AKP染色各比較3例患者的白內(nèi)障晶體上皮細胞和人皮膚成纖維細胞誘導生成iPSCs的效率差異,在1×106的細胞接種密度下,白內(nèi)障晶體上皮細胞平均可生成27.7個AKP陽性的細胞克隆,而人皮膚成纖維細胞平均僅生成15個細胞克隆。白內(nèi)障晶體上皮細胞誘導形成的iPSCs細胞克隆與ESCs在細胞形態(tài)上具有相似性。 結(jié)論構(gòu)建的慢病毒載體Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4能高效轉(zhuǎn)染白內(nèi)障晶體上皮細胞和人皮膚成纖維細胞,并成功誘導出與ESCs形態(tài)相似、AKP染色陽性的iPSCs,且白內(nèi)障晶體上皮細胞與人皮膚成纖維細胞相比具有更高的iPSCs誘導效率。 第三部分白內(nèi)障患者誘導性多能干細胞的鑒定 目的對誘導建立的白內(nèi)障患者來源的誘導性多能干細胞(iPSCs)進行鑒定,檢測細胞的分子標記及體內(nèi)外分化能力,評價其多能性。 方法對已成功誘導的白內(nèi)障患者來源的iPSCs進行多能性鑒定：基因表達、免疫熒光染色分析、RT-PCR檢測、體外分化擬胚體、體內(nèi)分化畸胎瘤檢測。提取iPSCs、ESCs和白內(nèi)障患者晶體上皮細胞的總RNA采用HG-U133-2array (Affymetrix)對三種細胞的全基因表達譜進行檢測并進行對比。提取iPSCs、 ESCs和白內(nèi)障患者晶體上皮細胞的總RNA, RT-PCR檢測人ESCs標志性基因(Nanog、OCT-4、REX-1、SOX-2、VIMENTIN)表達。采用細胞免疫組化熒光(immunohistochemistry, ICH)檢測人ESCs標志性抗原(SSEA-3、SSEA-4、Nanog、 TRA-60、TRA-81、OCT-4)的表達。將iPSCs懸浮培養(yǎng)觀察擬胚體(embryoid body,EB)形成,并在培養(yǎng)基中添加特殊成分(BMP4, FBS, retinoic acid (RA))觀察EB的體外分化。將iPSCs接種至裸鼠皮下,觀察畸胎瘤形成及體內(nèi)分化情況。 結(jié)果基因表達譜的分析結(jié)果顯示,iPSCs與ESCs(?)(?)基因表達譜極為相似,但與白內(nèi)障患者晶體上皮細胞的基因表達譜有較大差異。我們選擇了1例56歲的年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的iPSCs,并隨機選擇其中4個細胞克隆(分別命名為iPS1、iPS2、iPS3、iPS4)進行檢測。RT-PCR檢測的結(jié)果顯示,iPS1與ESCs的ESCs標志性基因Nanog、OCT-4、REX-1、SOX-2和VIMENTIN的表達最為相似,而其他3株克隆與ESCs存在一定的差異。對iPS1進行ICH檢測顯示,人ESCs標志性抗原(SSEA-3、SSEA-4、Nanog、TRA-60、TRA-81、OCT-4)在iPS1中明顯表達。體外分化擬胚體的結(jié)果顯示,EB的分化使得Nanog和OCT-4表達下調(diào),培養(yǎng)基中分別添加BMP4、FBS、RA之后,外胚層標志性基因NACM、TH和GFAP/內(nèi)胚層標志性基因amylase、SOX7和AFP/中胚層標志性基因PECAM、desmin和SCL在EB中的表達均出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)表達。對EB細胞進行ICH檢測結(jié)果顯示,EB細胞表達中胚層標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、外胚層標志物β-微管蛋白(tubulin beta1, Tuj-1)和內(nèi)胚層標志物甲胎蛋白(α-fetoprotein, AFP)。體內(nèi)分化畸胎瘤的結(jié)果顯示,裸鼠注射iPSCsl個月左右可在裸鼠注射部位見腫塊形成,2個月后摘除腫瘤進行組織切片檢查,鏡下可見三個胚層的組織細胞。 結(jié)論研究誘導的iPSCs在基因表達譜、ICH、RT-PCR檢測、體內(nèi)外分化能力方面與ESCs極為相似,建立的iPSCs具有與ESCs相同的多向分化能力。 第四部分白內(nèi)障患者誘導性多能干細胞向晶體前體細胞的分化誘導 目的探討利用誘導因子三步法將白內(nèi)障患者來源的多能干細胞誘導為晶體前體細胞的方法,評價分化細胞與晶體細胞的相似性。 方法對已成功誘導的白內(nèi)障患者晶體上皮細胞來源的iPSCs及ESCs進行三步法的分化誘導：在細胞培養(yǎng)基中添加(1)第0～5天100ng/ml Noggin;(2)第5～15天100ng/ml bFGF、20ng/ml BMP4和20ng/ml BMP7;(3)第15～30天100ng/ml FGF2和20ng/ml Wnt-3a.每5天提取iPSCs和ESCs的RNA, RT-PCR檢測晶體細胞分化標志基因PAX6、SCX2、SIX3、CRYAB、CRYAA、BFSP1和MIP表達情況,并繪制變化曲線。采用ICH檢測分化過程中晶體細胞分化標志PAX6、α晶體蛋白和β-晶體蛋白的表達。提取iPSCs、ESCs和人晶體的總蛋白,Western-blot法檢測晶體細胞分化標志PAX6、α-晶體蛋白和β-晶體蛋白的表達水平并進行比較。取3例人晶狀體,分別為22歲、44歲和65歲,提取總蛋白,并提取白內(nèi)障患者晶體上皮細胞來源的iPSCs、人皮膚成纖維細胞來源的iPSCs及ESCs的總蛋白,Western-blot法檢測間隙連接蛋白43(connexin43)和纖維連接蛋白(fibronectin),以評價其上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transitions, EMT)的程度。 結(jié)果經(jīng)過三階段誘導因子的作用后,對發(fā)生分化的iPSCs和ESCs進行的RT-PCR檢測顯示,PAX6、CRYAB、CRYAA、BFSP1和MIP的表達持續(xù)上升,SOX2的表達持續(xù)下降,SIX3的表達則是先上升后下降。ICH檢測的結(jié)果顯示分化過程中,iPSCs出現(xiàn)了晶體細胞分化標志PAX6、α-晶體蛋白和β-晶體蛋白的持續(xù)表達。Western-blot的結(jié)果顯示,iPSCs、ESCs和人晶體中均有PAX6、α-晶體蛋白和β-晶體蛋白的表達,但ESCs的蛋白表達水平相對較低。EMT評價的結(jié)果顯示,connexin43在22歲晶體中表達量最高,隨著年齡的增加而明顯降低,fibronectin則隨著年齡的增加表達量逐漸增高；而在白內(nèi)障患者晶體上皮細胞來源、人皮膚成纖維細胞的iPSCs及ESCs誘導分化的細胞中,connexin43在白內(nèi)障患者來源的細胞中表達量最高,而fibronectin(?)勺表達相似。 結(jié)論三階段誘導因子的組合作用能夠成功誘導出晶體前體細胞,且誘導分化的細胞能夠穩(wěn)定表達晶體細胞的標志性基因及蛋白。白內(nèi)障患者晶體上皮細胞來源的iPSCs(?)比人皮膚成纖維細胞來源的iPSCs及ESCs具有更低的EMT程度。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R776.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號：1727042