本文選題：腫瘤壞死因子-α　切入點：人晶狀體上皮細胞　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景與目的后發(fā)性白內(nèi)障(又稱后囊膜渾濁,posterior capsular opacification, PCO)是目前白內(nèi)障術(shù)后最主要的并發(fā)癥,其主要的病理機制是術(shù)后殘留的晶狀體上皮在活化或升高的細胞因子等作用下發(fā)生細胞增殖、遷移和上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化等。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子-α (TNF-α)是白內(nèi)障術(shù)后房水中存在的一種重要的炎癥因子,被認為和PCO的形成有關(guān)。另外有研究表明環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)抑制劑在體內(nèi)實驗和體外模擬實驗中均可以有效地抑制PCO的發(fā)生,但其藥理作用的分子機制仍不明確。因此本學(xué)位論文旨在通過體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞模型,探究TNF-α對COX-2的表達調(diào)控機制,及COX-2在TNF-α誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細胞增殖和轉(zhuǎn)分化中的作用及其可能的機制。方法體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞(hLEC-B3)分為兩組,即10 ng/ml TNF-α刺激組和無TNF-α刺激的對照組,在刺激后6 h、24 h、48 h,用實時定量PCR和Western Blot檢測COX-2 mRNA和蛋白的表達水平。同時,經(jīng)TNF-a刺激后24 h,用定量PCR和Western Blot檢測細胞增殖和EMT的標(biāo)志物細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和波形蛋白(Vimentin) mRNA及蛋白表達水平,并用Cell Count Kit-8(CCK-8)試劑盒和Transwell遷移小室實驗分別檢測細胞增殖和遷移能力。在光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。在TNF-α刺激前加入溴芬酸鈉24 h以阻斷COX-2,然后檢測細胞增殖和EMT的改變。觀察hLEC-B3細胞經(jīng)10 ng/ml TNF-α刺激時間梯度效應(yīng),用Western Blot檢測JNK磷酸化水平的改變以及轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的活化水平,提取細胞核蛋白的檢測和細胞免疫熒光的方法來觀察p-c-Jun的入核情況。預(yù)先加入JNK抑制劑SP600125或轉(zhuǎn)染c-Jun siRNA后檢測COX-2表達的改變,以鑒定JNK信號通路對COX-2表達的調(diào)控作用,并利用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)驗證p-c-Jun與COX-2啟動子區(qū)DNA序列的直接相互作用。為進一步探索COX-2可能介導(dǎo)的機制,通過Western Blot及雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的方法來研究TNF-α對GSK-3β/β-catenin通路以及β/-catenin轉(zhuǎn)錄活性的影響,并通過阻斷COX-2或JNK通路以探究JNK/COX-2在GSK-3β/β-catenin通路活化中的作用。結(jié)果TNF-α可以誘導(dǎo)hLEC-B3細胞COX-2的高表達以及Cyclin D1和Vimentin表達的升高,并促進細胞增殖、遷移和纖維化形態(tài)改變。預(yù)先加入澳芬酸鈉阻斷COX-2可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的Cyclin D1和Vimentin的高表達及細胞增殖和EMT。TNF-α通過激活JNK/p-c-Jun信號通路調(diào)控COX-2的表達,ChIP-qPCR結(jié)果顯示p-c-Jun與COX-2啟動子區(qū)DNA序列具有直接相互作用。另外,TNF-α可以激活GSK-3β/β-catenin通路并提高β-catenin轉(zhuǎn)錄活性。藥物阻斷COX-2或JNK信號通路均可以抑制TNF-a活化的GSK-3β/β-catenin通路和β-catenin轉(zhuǎn)錄活性。轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA可減弱了溴芬酸鈉對TNF-α誘導(dǎo)的Cyclin D1和Vimentin高表達的抑制效應(yīng)。結(jié)論TNF-α通過JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控COX-2的表達。JNK/COX-2可能通過介導(dǎo)GSK-3β/β-catenin通路,在TNF-α誘導(dǎo)的hLEC-B3細胞增殖和EMT中發(fā)揮了重要作用。
[Abstract]:Background and objective after cataract (also known as posterior capsular opacification, posterior capsular opacification, PCO) is the main complication after cataract surgery, the main pathological mechanism of postoperative residual lens epithelial cell proliferation occurs in the activation or elevated cytokines induced by migration and epithelial to mesenchymal. The study found that differentiation. Tumor necrosis factor alpha (TNF- alpha) is an important inflammatory factor in aqueous humor after cataract surgery, is believed to form and PCO. Other studies have shown that cyclooxygenase -2 (Cyclooxygenase-2, COX-2) can effectively inhibit the occurrence of inhibitors of PCO in vivo and in vitro in the simulation experiment, but the molecular mechanism of pharmacological action is still not clear. Therefore, this dissertation aims to model human lens epithelial cells by in vitro culture, explore the mechanism of expression and regulation of TNF- alpha on COX-2 And the mechanism of the proliferation of human lens epithelial cells and COX-2 in TNF- induced transdifferentiation and the role and possible. Human lens epithelial cells in vitro (hLEC-B3) were divided into two groups, namely control group 10 ng/ml TNF- stimulation group and TNF- stimulation, after stimulation of 6 h, 24 h 48, H expression by real-time quantitative PCR and Western Blot detection of COX-2 mRNA and protein. At the same time, after stimulated by TNF-a 24 h, Western Blot and PCR signs of quantitative detection of cell proliferation and cell cycle protein EMT D1 (Cyclin D1) and vimentin (Vimentin) expression of mRNA and protein, and Cell Count Kit-8 (CCK-8) Transwell kit and cell migration experiment were used to detect the proliferation and migration of cells. Morphological changes were observed under optical microscope. The TNF- stimulation before adding bromfenac sodium 24 h to block COX-2, then detected the proliferation and EMT cell changes. HLEC-B3 cells were observed after 10 ng/ml TNF- stimulation time gradient effect, using Western Blot to detect the change of JNK phosphorylation level and the activation level of the transcription factor c-Jun, extraction method and immunofluorescence to observe the nuclear protein p-c-Jun into the nucleus. The pre accession to the JNK inhibitor SP600125 or c-Jun siRNA to detect the expression of COX-2 after transfection the change of role in identification of JNK signaling pathway on the expression of COX-2, and the use of chromatin immunoprecipitation (ChIP) validation of p-c-Jun with COX-2 promoter direct interaction promoter sequence of DNA. To further explore the mechanism of COX-2 may be mediated by Western, Blot and dual luciferase reporter system to study TNF- the effect of alpha GSK-3 beta beta beta / -catenin pathway and transcriptional activity of /-catenin, and by blocking COX-2 or JNK pathway to explore the JNK/COX-2 in the GSK-3 beta / beta -catenin pathway. In the interactions of the TNF- alpha hLEC-B3 cells can be induced by the high expression of COX-2 and Cyclin expression of D1 and Vimentin increased, and promote cell proliferation, migration and fibrosis change form. Pretreatment with acid sodium can inhibit offen blocked COX-2 induced by TNF- Cyclin D1 and the high expression of Vimentin and cell proliferation and EMT.TNF- expression by alpha the activation of JNK/p-c-Jun signal transduction pathway of COX-2, p-c-Jun and ChIP-qPCR showed that COX-2 promoter DNA sequence has a direct interaction. In addition, TNF- can activate GSK-3 alpha beta / beta -catenin pathway and increased beta -catenin transcription activity. Drugs blocking COX-2 or JNK signaling pathway can inhibit the activation of TNF-a GSK-3 pathway and -catenin / beta beta beta the transcriptional activity of -catenin. Transfection beta -catenin siRNA can weaken the inhibitory effect of high expression of bromfenac sodium on TNF- induced Cyclin D1 and Vimentin. Conclusion TNF- alpha by JN K signal transduction pathway regulates the expression of COX-2..JNK/COX-2 may play an important role in TNF- induced hLEC-B3 cell proliferation and EMT by mediating the GSK-3 beta / -catenin pathway.

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R776.1

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本文編號：1719302