本文選題：慢性鼻竇炎　切入點(diǎn)：炎癥　出處：《華中科技大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：第一部分慢性鼻-鼻竇炎組織重塑與炎癥的相關(guān)性研究 [研究背景及目的] 慢性鼻-鼻竇炎(Chronic rhino sinusitis, CRS)是鼻-鼻竇黏膜的持續(xù)性炎癥,是臨床上多種疾病的總稱,人群患病率約15%。按照國(guó)人的炎癥類型和組織學(xué)類型的不同分為伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎(CRSwNP)和不伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎(CRSsNP),其中根據(jù)嗜酸性粒細(xì)胞的百分比,又將伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎分為嗜酸性粒細(xì)胞性鼻息肉(Eos CRSwNP)和非嗜酸性粒細(xì)胞性鼻息肉(non-Eos CRSwNP).對(duì)中國(guó)人的CRS的免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn),CRSsNP和CRSwNP的患者都表現(xiàn)為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的功能缺陷和TH1/TH2/TH17的反應(yīng)增強(qiáng).CRSsNP主要以TH1反應(yīng)為主,Eos CRSwNP主要以TH2/TH17反應(yīng)為主,伴隨自然殺傷性T細(xì)胞的浸潤(rùn),而non-Eos CRSwNP占中國(guó)人CRSwNP的一半以上,卻沒有上述炎癥表現(xiàn)。 大量的研究表明,氣道的重塑包括上皮、間質(zhì)和黏膜下的改變,最終導(dǎo)致氣道壁增厚。組織學(xué)上以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞增殖、血管形成、結(jié)締組織增多和組織破壞為特征。大量研究表明,這種重塑現(xiàn)象同樣存在于CRS中,不同亞型的慢性鼻竇炎表現(xiàn)出不同的組織重塑特征。迄今為止,典型的鼻息肉組織重塑表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)中白蛋白積聚和水腫形成(即假性囊腫)。目前的研究表明這是因?yàn)楸窍⑷庵邢鄬?duì)缺乏TGF-β1信號(hào),細(xì)胞外基質(zhì)缺乏膠原的形成。與此相反,CRSsNP以TH1反應(yīng)為主,伴隨高水平的IFN-gamma和活化的TGF-β1信號(hào),以及因此導(dǎo)致的過量的膠原沉積和纖維化形成。然而,對(duì)于不同類型的CRS,特別是Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP之間的差別,這種重塑的特征很少見諸報(bào)道。此外,組織的重塑是否和炎癥類型有關(guān)也是一個(gè)具有爭(zhēng)議的話題。 本研究就旨在揭示不同類型的CRS的組織學(xué)特征及其與炎癥類型之間的關(guān)系。具體研究目標(biāo) 1.分析不同類型的CRS組織學(xué)特征,及其在各組中的比例。 2.分析不同類型CRS的炎癥類型。 3.研究不同的組織學(xué)特征和炎癥類型之間的關(guān)系,是否有相關(guān)性。 [研究方法] 1.組織學(xué)分析 ①免疫組織化學(xué)方法HE染色檢測(cè)不同類型CRS的組織學(xué)特征,按照Hellquist的分類,將CRS分為纖維化型、水腫型、腺體型和不典型型。由于不典型型非常罕見,且組織學(xué)體現(xiàn)為肉瘤或惡變的細(xì)胞學(xué)特征,事實(shí)上隨訪研究并不支持腫瘤的診斷。因此,我們暫不考慮這一型。 ②分析每種組織學(xué)類型在各種CRS中的比例。 ③Masson染色,分析各種CRS亞型的水腫評(píng)分和膠原比例。 ④免疫組織化學(xué)檢測(cè)TGF-β2, MPO、 HIF-1α、α-SMA、fibronectin、TIMP-4等蛋白的定位、分布和表達(dá)量。計(jì)數(shù)HE染色切片每高倍鏡視野下嗜酸性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)。 ⑤連續(xù)切片免疫組化染色觀察分析MPO陽性細(xì)胞與TGF-β2或HIF-1α陽性細(xì)胞之間的關(guān)系。 2.實(shí)時(shí)定量RT-PCR 檢測(cè)可能與組織重塑有關(guān)的細(xì)胞因子,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α、肝素結(jié)合上皮生長(zhǎng)因子heparin-binding epithelial growth factor (HB-EGF),白介素interleukin(IL)-8,嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白eosinophilcationic protein (ECP),金屬基質(zhì)蛋白酶metalloproteinase (MMP)-2, MMP-7,金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑TIMP-1and TIMP-4等的mRNA含量。 3.相關(guān)性分析 分析上述有意義的指標(biāo)間的相關(guān)性,判斷組織重塑與炎癥類型之間的相關(guān)性。 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果] 1.不同類型的CRS的重塑類型 ①根據(jù)Hellquist的分類,CRS基于組織學(xué)特征可分為水腫型、腺體增生型、纖維型和非典型型。而非典型型的特征為間質(zhì)中大而多形性的組織細(xì)胞,這一類型非常罕見,因此本文著重研究其他三種類型。 ②Eos CRSwNP中水腫型最常見[70.8%(51/72)],比例顯著高于non-Eos CRSwNP[43.4%(33/76)](P=0.001)和CRSsNP[20.8%(15/72)](P=0.000)。non-Eos CRSwNP水腫型的比例顯著高于CRSsNP(P=0.005)。 ③與此相反,Eos CRSwNP中纖維型比例最少見[12.5%(9/72)],顯著少于non-Eos CRSwNP[37.1%(26/70)](P=0.001)和CRSsNP[49.3%(38/77)](P=0.000)。 ④盡管腺體增生型的比例從Eos CRSwNP[16.7%(12/72)]到non-Eos CRSwNP[20.0%(14/70)]到CRSsNP[29.9%(23/77)]呈遞增趨勢(shì),但是沒有顯著性差異。 ⑤Masson染色發(fā)現(xiàn)在Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP中膠原的含量顯著低于Controls,而CRSsNP的膠原含量顯著高于Controls.盡管在Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP的膠原含量均少于CRSsNP,但是non-Eos CRSwNP的膠原含量顯著高于Eos CRSwNP. ⑥與此相反,Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP的水腫評(píng)分顯著高于CRSsNP和Controls;而Eos CRSwNP的水腫評(píng)分顯著高于non-Eos CRSwNP. 2.α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)和纖維蛋白原(fibronectin)的表達(dá) ①a-SMA陽性染色主要分布于間質(zhì),在上皮無表達(dá)。間質(zhì)中a-SMA陽性的應(yīng)力纖維除了血管壁的成分外均被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts)肌成纖維細(xì)胞的數(shù)目從Eos CRSwNP、non-Eos CRSwNP和CRSsNP呈現(xiàn)遞增趨勢(shì),但只有Eos CRSwNP和CRSsNP之間存在顯著性差異。 ②纖維蛋白原的表達(dá)情況與α-平滑肌肌動(dòng)蛋白一致。 3.生長(zhǎng)因子、蛋白酶和蛋白酶抑制劑的表達(dá) ①我們檢測(cè)了TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3的m RNA水平,發(fā)現(xiàn)在各種類型的CRS中,TGF-β1水平均較對(duì)照組(Controls)下降；而CRSsNP中TGF-β2的mRNA水平顯著高于Eos CRSwNP和Controls; TGF-β3的mRNA水平在幾組中無顯著性差異。 ②CRSsNP中HB-EGF的mRNA水平顯著高于non-Eos CRSwNP、Eos CRSwNP和Controls. ③此外,我們檢測(cè)了MMP-2、MMP-7、TIMP-1和TIMP-4的mRNA水平。EosCRSwNP和non-Eos CRSwNP中MMP-2的水平顯著低于Controls,而MMP-7的水平在CRS各組中均較Controls組上調(diào)。而TIMP-4在Eos CRSwNP中的mRNA水平顯著低于Controls和CRSsNP; TIMP-1的mRNA水平在各種中無顯著差異。 ④基于上述的mRNA水平的檢測(cè),我們進(jìn)一步檢測(cè)了鼻黏膜中TGF-β2和TIMP-4蛋白水平的表達(dá),發(fā)現(xiàn)TGF-β2和TIMP-4均表達(dá)與黏膜的上皮和間質(zhì)。TGF-β2陽性的細(xì)胞廣泛分布于各種CRS的間質(zhì)。而TIMP-4陽性細(xì)胞主要分布于腺體細(xì)胞和血管和腺體周圍的細(xì)胞。所有類型的CRS間質(zhì)中TGF-β2陽性的細(xì)胞顯著多于Controls,而在CRSsNP中的表達(dá)顯著多于Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP.但是上皮中TGF-β2的表達(dá)在各種中無顯著差異。CRSsNP間質(zhì)中TIMP-4陽性細(xì)胞顯著多于Eos CRSwNP、non-Eos CRSwNP和Controls;而TIMP-4在Eos CRSwNP的表達(dá)顯著低于其他組。TIMP-4在各組上皮的表達(dá)無顯著性差異。 4.炎癥和組織重塑之間的關(guān)系 ①我們?cè)u(píng)估了不同類型CRS的炎癥類型。相比于Controls, non-Eos CRSwNP和CRSsNP, Eos CRSwNP中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量和ECP的mRNA水平顯著上調(diào)。與此相反,中性粒細(xì)胞(MPO陽性細(xì)胞)的數(shù)量在所有類型的CRS中顯著高于Controls;且中性粒細(xì)胞的數(shù)量從Eos CRSwNP到non-Eos CRSwNP再到CRSsNP呈現(xiàn)顯著的遞增趨勢(shì)。IL-8的mRNA水平在CRSsNP中較其他組顯著上調(diào)。此外,我們檢測(cè)了能反應(yīng)病變鼻竇低氧狀態(tài)的HIF-1α的表達(dá)水平。從Controls-Eos CRSwNP-non-Eos CRSwNP-CRSsNP, HIF-la的mRNA水平和蛋白表達(dá)呈現(xiàn)遞增趨勢(shì),但只有在Controls和non-Eos CRSwNP之間、EosCRSwNP和CRSsNP之間呈現(xiàn)顯著性差異。HIF-1α主要表達(dá)于間質(zhì)中炎性細(xì)胞的胞核,少數(shù)表達(dá)于上皮細(xì)胞的胞核。 ②分析炎癥指標(biāo)和重塑介質(zhì)之間的相關(guān)性,我們發(fā)現(xiàn),中性粒細(xì)胞數(shù)與這些前纖維化因子呈正相關(guān),而ECP的mRNA水平與其呈負(fù)相關(guān)。相反,ECP的mRNA水平與水腫嚴(yán)重程度呈正相關(guān)而中性粒細(xì)胞數(shù)與其呈反相關(guān)。此外,還發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞的數(shù)量與IL-8和HIF-1α的表達(dá)水平呈正相關(guān),而ECP的mRNA水平與其呈反相關(guān)。TGF-β2陽性的細(xì)胞數(shù)與肌成纖維細(xì)胞數(shù)(r=0.715,P0.05)和纖維蛋白原的表達(dá)水平(r=0.696,P0.05)呈正相關(guān)。此外,HB-EGF與TGF-β2的表達(dá)之間呈正相關(guān)(r=0.702,P=0.03)。HIF-1α mRNA水平與IL-8(r=0.517,P0.05)和TGF-β2(r=0.629,P0.05)mRNA水平呈正相關(guān)。 ③為了更進(jìn)一步驗(yàn)證中性粒細(xì)胞和TGF-β2及HIF-1α之間的關(guān)系,我們利用免疫組化連續(xù)切片觀察中性粒細(xì)胞和TGF-β2之間,以及中性粒細(xì)胞和HIF-1α之間的染色定位及相關(guān)性。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)在controls組中,TGF-β2陽性的中性粒細(xì)胞占TGF-β2陽性細(xì)胞數(shù)的26%；在Eos CRSwNP中占40%；在non-Eos CRSwNP中占60%；在CRSsNP中占77%。TGF-β2陽性的中性粒細(xì)胞比例在各種CRS中顯著高于controls組(P0.05),而在non-Eos CRSwNP和CRSsNP中顯著高于Eos CRSwNP。TGF-β2陽性的中性粒細(xì)胞占所有中性粒細(xì)胞的比例在controls組為79%,Eos CRSwNP組為75%,non-Eos CRSwNP組為80%,CRSsNP組為85%,這幾組中的比例無顯著性差異。對(duì)于HIF-1α,我們發(fā)現(xiàn)在controls組中HIF-1α陽性的中性粒細(xì)胞數(shù)占HIF-1α總陽性細(xì)胞的20%,在Eos CRSwNP中占26%,non-Eos CRSwNP中37%,在CRSsNP中占43%；這一比例在non-Eos CRSwNP和CRSsNP中顯著高于controls組和EosCRSwNP組(P0.05)。另外,在controls組中HIF-1α陽性的中性粒細(xì)胞數(shù)占總的中性粒細(xì)胞數(shù)的78%,在Eos CRSwNP中占81%,在non-Eos CRSwNP中占85%,在CRSsNP中占87%；這幾組中的陽性比例無顯著性差異。non-Eos CRSwNP和CRSsNP中的TGF-β2和HIF-1α陽性的中性粒細(xì)胞數(shù)顯著高于controls組和Eos CRSwNP(P0.05)。 [結(jié)論] 不同類型的CRS具有不同的組織重塑形式,特別是對(duì)于Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP來說體現(xiàn)的尤為明顯。組織重塑與CRS的炎癥類型具有相關(guān)性。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R765.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1702594