本文選題：甲狀腺相關(guān)眼病　切入點(diǎn)：前脂肪細(xì)胞　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景:隨著現(xiàn)代社會(huì)環(huán)境、社會(huì)人群心理狀態(tài)及生活習(xí)慣的改變,甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)的發(fā)病率呈現(xiàn)一種逐漸上升趨勢(shì)。在美國(guó)每年大約有37000例新發(fā)病例,每10萬人口年平均約有16例女性和2.9例男性發(fā)病的患者。它是一種與內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病,確切的發(fā)病機(jī)制不清楚,最近研究表明Ig G4可能與它也存在一定相關(guān)性。該病多雙眼發(fā)病,以眼球突出、眼瞼腫脹退縮、上瞼遲落、結(jié)膜充血水腫、眼外肌麻痹等為主要臨床表現(xiàn),嚴(yán)重時(shí)可由于眶內(nèi)肌肉組織壓迫視神經(jīng)或眼球過于突出而形成暴露性角膜炎導(dǎo)致失明。從病理學(xué)來看,它主要是由于眶內(nèi)脂肪組織增多和眼外肌肥厚纖維化及炎性病變?yōu)樘攸c(diǎn)。其中眶內(nèi)脂肪組織病變?cè)诎l(fā)病中占據(jù)了很重要的作用。作為自身免疫性疾病促甲狀腺素受體(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)多年來被認(rèn)為是TAO自身免疫主要抗原。但對(duì)于自身抗原究竟是一種還是多種參與一直沒有定論。在早期的研究中就曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)TSHR抗體免疫沉淀復(fù)合物可以有效地作用在胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(insulin-like growth factor receptor-1,IGF-1R)上,并且認(rèn)為它可能參與了疾病發(fā)展過程。近幾年有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)提出了TSHR/IGF-1R的復(fù)合共同體學(xué)說,他們通過免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)IGF-1Rβ亞單位與TSHR共同存在于Graves’眼病(Graves’ophthalmopathy,GO)患者眼眶成纖維細(xì)胞和甲狀腺上皮細(xì)胞中,加入IGF-1R的拮抗劑后可以明顯抑制GD-Ig G的信號(hào)傳導(dǎo)作用。后期的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了IGF-1R在TAO的發(fā)病中起了很關(guān)鍵的作用。而作為IGF-1R的配體胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)是組織生長(zhǎng)代謝的重要因子,它可以促進(jìn)成纖維組織透明質(zhì)酸鈉及粘多糖的合成,而GO眼眶組織病理改變與粘多糖沉積有直接的關(guān)系。雖然IGF-1主要來源于肝臟組織細(xì)胞但也在其他組織中發(fā)現(xiàn)分泌現(xiàn)象,敲除基因小鼠的實(shí)驗(yàn)里發(fā)現(xiàn)脂肪組織中IGF-1升高明顯,推測(cè)脂肪組織也可能分泌IGF-1。在甲狀腺相關(guān)眼病的臨床研究中也發(fā)現(xiàn)疾病組中血清IGF-1較對(duì)照組有明顯升高。另外Delu在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甲狀腺相關(guān)性眼病患者中成纖維細(xì)胞存在IGF-1自分泌的現(xiàn)象。以上都表明IGF-1R及配體IGF-1可能在TAO發(fā)病中發(fā)揮一定作用。IGF-1自發(fā)現(xiàn)以來就不斷被證實(shí)并認(rèn)為它和與機(jī)體內(nèi)許多組織的增殖生長(zhǎng)及分泌功能有密切聯(lián)系。作為與胰島素家族類似的一種蛋白,IGF-1有著與胰島素很多相似的作用。已經(jīng)有研究表明胰島素可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞分泌纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1),PAI-1在體內(nèi)的主要作用是調(diào)節(jié)組織型纖溶酶原激活(tissue-type plasminogen activator,t-PA)和尿激酶型纖溶酶原激活(urokinase-type plasminogen activator,u-PA)兩者之間的代謝平衡,通過影響細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白代謝平衡而改變纖維化過程,這在肺、肝、皮膚等組織纖維化相關(guān)研究中都被證實(shí)。在對(duì)TAO患者淚液分析研究中發(fā)現(xiàn)GO組患者淚液中的PAI-1蛋白比Graves’病(Graves’disease,GD)組有明顯的提高,而且與病情的活動(dòng)程度有一定相關(guān)性。雖然具體相關(guān)機(jī)制還不清楚但這給了我們一些提示:GO患者眼眶組織中有可能存在PAI-1異常分泌的現(xiàn)象。TAO的發(fā)病除了與免疫性自身抗原有著明確的關(guān)系外,體內(nèi)其他一些生理機(jī)制的紊亂和異常也是導(dǎo)致其發(fā)生的重要原因。作為體內(nèi)一種重要內(nèi)在平衡機(jī)制的自噬是一種基因程序性的調(diào)控行為,在組織生長(zhǎng)代謝及自我保護(hù)方面起了重要作用。在一般生理情況下它通過降解或重新利用細(xì)胞器及相關(guān)蛋白來維持細(xì)胞自身的代謝平衡;在病理情況下則為細(xì)胞器的自身修復(fù)和再生提供必需的原料。自噬過程與人類很多疾病都關(guān)系緊密,其中也包括我們常見的一些自身免疫性疾病。比如在脫髓鞘和多發(fā)性硬化疾病相關(guān)研究過程中發(fā)現(xiàn)自噬蛋白Atg5在組織中出現(xiàn)了異常高表達(dá)現(xiàn)象。此外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞分化的過程也有自噬活動(dòng)的參與,在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化時(shí)通過電鏡可以觀察到自噬小體含量的增加。IGF-1R作為細(xì)胞重要的受體也參與了體內(nèi)一些組織自噬過程。盡管如此,甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病是否與自噬活動(dòng)有關(guān)還不清楚。本研究是建立在上述研究背景條件下,對(duì)眼眶脂肪組織及細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。第一部分首先主要通過對(duì)眼眶脂肪組織進(jìn)行IGF-1R蛋白及m RNA檢測(cè),希望了解TAO患者與對(duì)照組之間是否存在差異及蛋白分布情況;其次通過對(duì)原代眼眶前脂肪細(xì)胞進(jìn)行提取、培養(yǎng)、鑒定后,探討IGF-1對(duì)兩組細(xì)胞增殖能力的影響;最后觀察分化過程中IGF-1R變化和IGF-1自分泌情況及脂化作用;第二部分主要是了解TAO患者眼眶脂肪組織中PAI-1是否存在異常表達(dá)及分布情況,在前脂肪細(xì)胞分化過程中探討IGF-1對(duì)PAI-1的合成影響及相關(guān)機(jī)制;第三部分是通過對(duì)自噬標(biāo)志性LC3蛋白進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比TAO組和對(duì)照組患者眼眶脂肪組織中自噬水平變化情況,并探討眼眶前脂肪細(xì)胞分化過程是否存在自噬過程及影響其水平的相關(guān)機(jī)制。研究方法:1.應(yīng)用Western Blot和RT-PCR方法對(duì)TAO組和對(duì)照組的眼眶脂肪組織IGF-1R、PAI-1、LC3進(jìn)行檢測(cè);2.應(yīng)用免疫組化技術(shù)對(duì)TAO組和對(duì)照組的眼眶脂肪組織冰凍切片行IGF-1R、PAI-1定位及半定量檢測(cè);3.提取眼眶脂肪組織的原代前脂肪細(xì)胞,對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)、傳代,利用Pref-1特異性抗體通過流式細(xì)胞儀對(duì)前脂肪細(xì)胞細(xì)胞進(jìn)行鑒定及篩選;4.使用CCK8技術(shù)觀察不同濃度IGF-1(0n M,1n M,5n M,10n M,20n M)對(duì)眼眶前脂肪細(xì)胞增殖再生能力的影響;5.利用Western Blot技術(shù)觀察眼眶前脂肪細(xì)胞不同分化時(shí)間階段LC3、Atg5及分化前后IGF-1R蛋白表達(dá)情況;通過RT-PCR檢測(cè)分化后PAI-1、PPARγ、IGF-1的變化情況;6.不同濃度IGF-1(0n M,1n M,5n M,10n M,20n M)作用于分化的TAO前脂肪細(xì)胞組了解LC3、Atg5蛋白表達(dá)情況;通過RT-PCR檢測(cè)分化后PAI-1、PPARγ的變化情況;并利用油紅O染色檢測(cè)脂肪化程度;7.觀察PI3k抑制劑LY294002、AKT抑制劑MK2206對(duì)IGF-1作用下TAO前脂肪細(xì)胞分化時(shí)的作用,通過Western Blot檢測(cè)LC3、Atg5蛋白表達(dá)的變化情況,同時(shí)了解分化后PAI-1、PPARγ的改變情況。研究結(jié)果:1.Western Blot和免疫組化顯示TAO脂肪組織中IGF-1R、PAI-1蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組;而LC3蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組;2.TAO及對(duì)照組眼眶前脂肪維細(xì)胞體外分化無明顯差異;3.IGF-1可以促進(jìn)眼眶前脂肪細(xì)胞增殖,在TAO組更為明顯;4.TAO組前脂肪細(xì)胞IGF-1R蛋白在分化前后表達(dá)量高于對(duì)照組;5.TAO組前脂肪細(xì)胞分化過程中早期的LC3、Atg5表達(dá)與分化后PAI-1、PPARγm RNA表達(dá)與對(duì)照組無明顯差別;而IGF-1 m RNA表達(dá)量在TAO組要高于對(duì)照組;6.IGF-1抑制前脂肪細(xì)胞分化過程中LC3、Atg5蛋白表達(dá),促進(jìn)PAI-1m RNA、PPARγm RNA的表達(dá);7.IGF-1R通過PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路來調(diào)控前脂肪細(xì)胞分化中PAI-1m RNA、PPARγm RNA和LC3、Atg5蛋白的表達(dá)。結(jié)論:1.TAO眼眶脂肪組織及脂肪細(xì)胞高表達(dá)IGF-1R,IGF-1可以促進(jìn)眼眶前脂肪細(xì)胞增殖和分化;2.TAO眼眶前脂肪細(xì)胞分化過程中IGF-1自分泌明顯增強(qiáng);3.自噬在TAO眼眶脂肪組織中水平較低,前脂肪細(xì)胞體外分化早期階段可見較明顯自噬;4.TAO眼眶脂肪組織表達(dá)較多PAI-1,IGF-1可以促進(jìn)眼眶前脂肪細(xì)胞PAI-1的表達(dá);5.IGF-1R可以通過PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控前脂肪細(xì)胞分化和LC3、Atg5、PAI-1的表達(dá)。
[Abstract]:In recent years , there are about 37,000 new cases of thyroid - associated ophthalmos ( TSHR ) . In this study , it was found that the expression of PAI - 1 in the tears of the patients with GO was significantly higher than that of Graves ' disease . The expression of IGF - 1R and PPAR緯 was detected by Western Blot and Western Blot . The expression of IGF - 1R and PPAR緯 in the preadipocytes was higher than that in the control group . Conclusion : 1 . The expression of PAI - 1 mRNA , PPAR緯 mRNA and LC3 and Atg5 protein in preadipocytes were regulated by IGF - 1R signaling pathway .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R581;R771.3

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3 孫q，

本文編號(hào)：1688499