本文選題：β-神經(jīng)生長(zhǎng)因子　切入點(diǎn)：Tet-on　出處：《解剖學(xué)報(bào)》2017年04期

【摘要】：目的運(yùn)用Tet-on 3G四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)探討β-神經(jīng)生長(zhǎng)因子(β-NGF)在人胚腎(HEK293FT)細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)情況及其對(duì)角膜緣干細(xì)胞(LSCs)的作用。方法將p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和p LVX-Tet3G慢病毒在空白的HEK293FT細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,收獲慢病毒,再共轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞,同時(shí)用不同劑量強(qiáng)力霉素(Dox)誘導(dǎo)β-NGF表達(dá)(分為未轉(zhuǎn)染組、1000、100和1000μg/L Dox誘導(dǎo)表達(dá)組)。48 h后收集細(xì)胞,免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)β-NGF表達(dá)情況。體外分離培養(yǎng)LSCs,慢病毒共轉(zhuǎn)染LSCs,分為對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組)和誘導(dǎo)表達(dá)組[實(shí)驗(yàn)組A(慢病毒載體Dox 1000μg/L)、實(shí)驗(yàn)組B(慢病毒載體Dox 100μg/L)、實(shí)驗(yàn)組C(慢病毒空載體Dox 1000μg/L)],誘導(dǎo)表達(dá)48 h后細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)NGF及相關(guān)蛋白(p63、p38、Trk A)的表達(dá)情況。結(jié)果NGF在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)被誘導(dǎo)表達(dá),隨著Dox劑量增加,表達(dá)量增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組C相比,實(shí)驗(yàn)組A的p63表達(dá)降低,Trk A表達(dá)降低,p38表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組C相比,實(shí)驗(yàn)組B的p63表達(dá)增加,Trk A表達(dá)增加,p38表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論運(yùn)用Tet-on 3G四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng),可成功誘導(dǎo)表達(dá)不同劑量β-NGF蛋白,低劑量Dox誘導(dǎo)下NGF產(chǎn)生的微環(huán)境可促進(jìn)LSCs的體外擴(kuò)增,并能維持LSCs的干細(xì)胞特性。
[Abstract]:Objective to investigate the overexpression of 尾 -NGF in human embryonic kidney cell line HEK293FTs and its effect on limbal stem cells by using Tet-on 3G tetracycline induced expression system. Methods pLVX-TRE3G-IRES- 尾 -NGF and p LVX-Tet3G lentivirus were amplified in blank HEK293FT cells. Lentivirus was harvested and co-transfected into HEK293FT cells. 尾 -NGF expression was induced by doxycycline in different doses. The expression of 尾 -NGF was detected by Western blotting. LSCswere isolated and cultured in vitro. Lentivirus co-transfected LSCswere divided into two groups: control group (untransfected group) and induced expression group [experimental group A (lentivirus vector Dox 1000 渭 g / L), experimental group B (lentivirus). The expression of NGF and its associated protein, p63, p38, Trk A, was detected by cell immunofluorescence staining 48 h after induction and expression of lentivirus empty vector Dox (1000 渭 g / L). Results the expression of NGF was induced in transfected cells. Compared with the control group and the experimental group C, the expression of p63 in experimental group A decreased and the expression of TrkA decreased, and the expression of p38 increased. Compared with the control group and the experimental group C, the expression of p63 in experimental group B increased, and the expression of p38 decreased. Conclusion the expression system of tetracycline induced by Tet-on 3G was used. 尾 -NGF protein was successfully induced and expressed in different doses. The microenvironment of NGF induced by low dose Dox could promote the expansion of LSCs in vitro and maintain the stem cell character of LSCs.
【作者單位】： 貴州醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)胚胎學(xué)教研室;貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心;貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：貴州省科技廳基金[黔科合J字(2015)2011號(hào)] 貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)基金[黔省專合字(2012)41號(hào)]
【分類號(hào)】：R77

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1681521