本文選題：IFI16　切入點：Hep-2　出處：《杭州師范大學》2012年碩士論文

【摘要】：喉鱗癌是頭頸部常見惡性腫瘤,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。目前,對喉癌等惡性腫瘤的傳統(tǒng)治療方法是手術、放療和化療。這些傳統(tǒng)的方法對于治療晚期的喉癌病人沒有很大意義,所以近年來興起綜合治療備受關注,干擾素就是其中一種。研究發(fā)現(xiàn),作為干擾素可誘導家族HIN-200蛋白家族成員,人中的IFI16蛋白和小鼠中的p202蛋白都與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)發(fā)病有關。多個研究證明HIN-200家族蛋白具有抑制細胞增殖的作用。由于這個原因,研究人員開始著手于研究IFI16基因的抗腫瘤作用。目前已知IFI16基因具有抗乳腺癌,前列腺癌的作用,并且在頭頸部鱗狀細胞癌HNO136細胞中表現(xiàn)出抑制細胞生長的作用。 本研究將RT-PCR擴增得到的IFI16基因構建到真核表達質(zhì)粒pVR1012,得到PVR1012-IFI16重組質(zhì)粒,用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染導入Hep-2細胞,半定量RT-PCR分析IFI16基因在Hep-2細胞中的外來表達情況,細胞生長曲線繪制法及MTT法測定IFI16基因外來表達對Hep-2細胞增殖的影響,流式細胞術檢測IFI16基因外來表達對Hep-2細胞周期及凋亡的影響；合成針對IFI16基因的shRNA,構建慢病毒表達載體pGreen Puro-IFI16-shRNA,用磷酸鈣將其轉(zhuǎn)染Hep-2細胞構建穩(wěn)定表達這個載體的Hep-2細胞系.半定量RT-PCR分析結果發(fā)現(xiàn),pVR1012-IFI16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hep-2細胞IFI16基因mRNA水平顯著升高；細胞生長曲線測定結果發(fā)現(xiàn),第2天開始pVR1012-IFI16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hep-2細胞生長變慢,至第3天時pVR1012-IFI16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep-2細胞其生長速度明顯變慢,與mock轉(zhuǎn)染及空載體轉(zhuǎn)染對照細胞相比差異顯著(P0.05)；MTT測定結果發(fā)現(xiàn),pVR1012-IFI16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep-2細胞48h后,其相對活細胞數(shù)目顯著降低,與mock轉(zhuǎn)染及空載體轉(zhuǎn)染對照細胞相比差異十分顯著(P0.05及P0.01)；流式細胞術檢測結果發(fā)現(xiàn),與mock轉(zhuǎn)染及空載體轉(zhuǎn)染對照細胞相比,pVR1012-IFI16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后Hep-2細胞亞GO期細胞比例以及凋亡細胞比例都顯著升高。上述研究結果說明,構建得到的pVR1012-IFI16重組質(zhì)粒能在Hep-2細胞中外來表達IFI16基因,IFI16基因外來表達抑制Hep-2細胞增殖、阻滯Hep-2細胞周期在亞GO期并誘導Hep-2細胞發(fā)生凋亡；成功構建得到pGreen Puro-IFI16-shRNA,并且構建穩(wěn)定表達pGreen Puro-control-shRNA的Hep-2細胞系,穩(wěn)定表達pGreen Puro-IFI16-shRNA也已經(jīng)在構建當中。 本實驗希望采用外來過表達技術來研究IFI16基因?qū)τ贖ep-2細胞生長的影響,并且希望通過外來沉默技術作為輔助,驗證IFI16基因在喉癌Hep-2細胞中的作用。從上述結果中看出IFI16基因抑制喉癌Hep-2細胞生長增殖方面的作用,并且使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,流式細胞儀等檢測實驗有效地驗證這個猜測。這將為進一步闡明IFI16基因抑制喉癌Hep-2細胞生長增殖的分子機制奠定基礎。
[Abstract]:Laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) is a common malignant tumor in the head and neck, and its incidence is increasing year by year. Radiotherapy and chemotherapy. These traditional methods do not have much significance in the treatment of advanced laryngeal cancer patients, so the rise of comprehensive therapy in recent years has attracted much attention. Interferon is one of them. As a member of the family of HIN-200 proteins induced by interferon, both IFI16 protein in human and p202 protein in mice are involved in the pathogenesis of SLEs. Several studies have shown that HIN-200 family proteins can inhibit cell proliferation. The researchers began to study the antitumor effects of IFI16 gene, which is known to have anti-breast and prostate cancer effects, and to inhibit cell growth in HNO136 cells of head and neck squamous cell carcinoma. In this study, the IFI16 gene amplified by RT-PCR was constructed into eukaryotic expression plasmid pVR1012, and the recombinant PVR1012-IFI16 plasmid was obtained. The recombinant plasmid was transfected into Hep-2 cells by liposome, and the extraneous expression of IFI16 gene in Hep-2 cells was analyzed by semi-quantitative RT-PCR. Cell growth curve drawing and MTT assay were used to detect the effect of foreign expression of IFI16 gene on the proliferation of Hep-2 cells. Flow cytometry was used to detect the effect of foreign expression of IFI16 gene on the cell cycle and apoptosis of Hep-2 cells. IFI16 gene was synthesized and lentivirus expression vector pGreen Puro-IFI16-shRNAwas constructed. The Hep-2 cell line expressing the vector stably was constructed by calcium phosphate transfection into Hep-2 cells. Semi-quantitative RT-PCR analysis showed that the IFI16 gene of Hep-2 cells transfected with recombinant plasmid pVR1012-IFI16 was constructed by semi-quantitative RT-PCR analysis. The level of mRNA increased significantly. The results of cell growth curve showed that the growth of Hep-2 cells transfected with pVR1012-IFI16 recombinant plasmid became slower on the second day, and at the third day, the growth rate of Hep-2 cells transfected with pVR1012-IFI16 recombinant plasmid was obviously slower. Compared with the control cells transfected with mock and empty vector, the results showed that the number of relative living cells decreased significantly 48 hours after transfection of pVR1012-IFI16 recombinant plasmid into Hep-2 cells. Compared with the control cells transfected with mock and empty vector, the difference was significant (P0.05) and P0.01G, the results of flow cytometry showed that, Compared with the control cells transfected with mock and empty vector, the proportion of subgo phase cells and the proportion of apoptotic cells in Hep-2 cells were significantly increased after transfection of pVR1012-IFI16 recombinant plasmid for 48 h. The constructed pVR1012-IFI16 recombinant plasmid could express IFI16 gene in Hep-2 cells and inhibit the proliferation of Hep-2 cells, block the cell cycle of Hep-2 cells in subgo phase and induce apoptosis of Hep-2 cells. PGreen Puro-IFI16-shRNAs were successfully constructed, and Hep-2 cell lines stably expressing pGreen Puro-control-shRNA were constructed. The stable expression of pGreen Puro-IFI16-shRNA was also in the process of construction. The purpose of this study is to study the effects of IFI16 gene on the growth of Hep-2 cells by using foreign overexpression techniques, and to use foreign silencing as an aid. To verify the role of IFI16 gene in laryngeal carcinoma Hep-2 cells. From the above results, we can see the role of IFI16 gene in inhibiting the growth and proliferation of laryngeal cancer Hep-2 cells, and transfection with liposome, Flow cytometry and other assays can effectively verify this hypothesis, which will lay a foundation for further elucidation of the molecular mechanism of IFI16 gene inhibiting the growth and proliferation of laryngeal cancer Hep-2 cells.
【學位授予單位】：杭州師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R739.65

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6 任s，

本文編號：1663695