本文選題：IFI16　切入點(diǎn)：Hep-2　出處：《杭州師范大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：喉鱗癌是頭頸部常見惡性腫瘤,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。目前,對(duì)喉癌等惡性腫瘤的傳統(tǒng)治療方法是手術(shù)、放療和化療。這些傳統(tǒng)的方法對(duì)于治療晚期的喉癌病人沒有很大意義,所以近年來興起綜合治療備受關(guān)注,干擾素就是其中一種。研究發(fā)現(xiàn),作為干擾素可誘導(dǎo)家族HIN-200蛋白家族成員,人中的IFI16蛋白和小鼠中的p202蛋白都與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)發(fā)病有關(guān)。多個(gè)研究證明HIN-200家族蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。由于這個(gè)原因,研究人員開始著手于研究IFI16基因的抗腫瘤作用。目前已知IFI16基因具有抗乳腺癌,前列腺癌的作用,并且在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌HNO136細(xì)胞中表現(xiàn)出抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。 本研究將RT-PCR擴(kuò)增得到的IFI16基因構(gòu)建到真核表達(dá)質(zhì)粒pVR1012,得到PVR1012-IFI16重組質(zhì)粒,用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染導(dǎo)入Hep-2細(xì)胞,半定量RT-PCR分析IFI16基因在Hep-2細(xì)胞中的外來表達(dá)情況,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制法及MTT法測(cè)定IFI16基因外來表達(dá)對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IFI16基因外來表達(dá)對(duì)Hep-2細(xì)胞周期及凋亡的影響；合成針對(duì)IFI16基因的shRNA,構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pGreen Puro-IFI16-shRNA,用磷酸鈣將其轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)這個(gè)載體的Hep-2細(xì)胞系.半定量RT-PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),pVR1012-IFI16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞IFI16基因mRNA水平顯著升高；細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn),第2天開始pVR1012-IFI16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)變慢,至第3天時(shí)pVR1012-IFI16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞其生長(zhǎng)速度明顯變慢,與mock轉(zhuǎn)染及空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞相比差異顯著(P0.05)；MTT測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn),pVR1012-IFI16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞48h后,其相對(duì)活細(xì)胞數(shù)目顯著降低,與mock轉(zhuǎn)染及空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞相比差異十分顯著(P0.05及P0.01)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與mock轉(zhuǎn)染及空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞相比,pVR1012-IFI16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后Hep-2細(xì)胞亞GO期細(xì)胞比例以及凋亡細(xì)胞比例都顯著升高。上述研究結(jié)果說明,構(gòu)建得到的pVR1012-IFI16重組質(zhì)粒能在Hep-2細(xì)胞中外來表達(dá)IFI16基因,IFI16基因外來表達(dá)抑制Hep-2細(xì)胞增殖、阻滯Hep-2細(xì)胞周期在亞GO期并誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞發(fā)生凋亡；成功構(gòu)建得到pGreen Puro-IFI16-shRNA,并且構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)pGreen Puro-control-shRNA的Hep-2細(xì)胞系,穩(wěn)定表達(dá)pGreen Puro-IFI16-shRNA也已經(jīng)在構(gòu)建當(dāng)中。 本實(shí)驗(yàn)希望采用外來過表達(dá)技術(shù)來研究IFI16基因?qū)τ贖ep-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,并且希望通過外來沉默技術(shù)作為輔助,驗(yàn)證IFI16基因在喉癌Hep-2細(xì)胞中的作用。從上述結(jié)果中看出IFI16基因抑制喉癌Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖方面的作用,并且使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,流式細(xì)胞儀等檢測(cè)實(shí)驗(yàn)有效地驗(yàn)證這個(gè)猜測(cè)。這將為進(jìn)一步闡明IFI16基因抑制喉癌Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) is a common malignant tumor in the head and neck, and its incidence is increasing year by year. Radiotherapy and chemotherapy. These traditional methods do not have much significance in the treatment of advanced laryngeal cancer patients, so the rise of comprehensive therapy in recent years has attracted much attention. Interferon is one of them. As a member of the family of HIN-200 proteins induced by interferon, both IFI16 protein in human and p202 protein in mice are involved in the pathogenesis of SLEs. Several studies have shown that HIN-200 family proteins can inhibit cell proliferation. The researchers began to study the antitumor effects of IFI16 gene, which is known to have anti-breast and prostate cancer effects, and to inhibit cell growth in HNO136 cells of head and neck squamous cell carcinoma. In this study, the IFI16 gene amplified by RT-PCR was constructed into eukaryotic expression plasmid pVR1012, and the recombinant PVR1012-IFI16 plasmid was obtained. The recombinant plasmid was transfected into Hep-2 cells by liposome, and the extraneous expression of IFI16 gene in Hep-2 cells was analyzed by semi-quantitative RT-PCR. Cell growth curve drawing and MTT assay were used to detect the effect of foreign expression of IFI16 gene on the proliferation of Hep-2 cells. Flow cytometry was used to detect the effect of foreign expression of IFI16 gene on the cell cycle and apoptosis of Hep-2 cells. IFI16 gene was synthesized and lentivirus expression vector pGreen Puro-IFI16-shRNAwas constructed. The Hep-2 cell line expressing the vector stably was constructed by calcium phosphate transfection into Hep-2 cells. Semi-quantitative RT-PCR analysis showed that the IFI16 gene of Hep-2 cells transfected with recombinant plasmid pVR1012-IFI16 was constructed by semi-quantitative RT-PCR analysis. The level of mRNA increased significantly. The results of cell growth curve showed that the growth of Hep-2 cells transfected with pVR1012-IFI16 recombinant plasmid became slower on the second day, and at the third day, the growth rate of Hep-2 cells transfected with pVR1012-IFI16 recombinant plasmid was obviously slower. Compared with the control cells transfected with mock and empty vector, the results showed that the number of relative living cells decreased significantly 48 hours after transfection of pVR1012-IFI16 recombinant plasmid into Hep-2 cells. Compared with the control cells transfected with mock and empty vector, the difference was significant (P0.05) and P0.01G, the results of flow cytometry showed that, Compared with the control cells transfected with mock and empty vector, the proportion of subgo phase cells and the proportion of apoptotic cells in Hep-2 cells were significantly increased after transfection of pVR1012-IFI16 recombinant plasmid for 48 h. The constructed pVR1012-IFI16 recombinant plasmid could express IFI16 gene in Hep-2 cells and inhibit the proliferation of Hep-2 cells, block the cell cycle of Hep-2 cells in subgo phase and induce apoptosis of Hep-2 cells. PGreen Puro-IFI16-shRNAs were successfully constructed, and Hep-2 cell lines stably expressing pGreen Puro-control-shRNA were constructed. The stable expression of pGreen Puro-IFI16-shRNA was also in the process of construction. The purpose of this study is to study the effects of IFI16 gene on the growth of Hep-2 cells by using foreign overexpression techniques, and to use foreign silencing as an aid. To verify the role of IFI16 gene in laryngeal carcinoma Hep-2 cells. From the above results, we can see the role of IFI16 gene in inhibiting the growth and proliferation of laryngeal cancer Hep-2 cells, and transfection with liposome, Flow cytometry and other assays can effectively verify this hypothesis, which will lay a foundation for further elucidation of the molecular mechanism of IFI16 gene inhibiting the growth and proliferation of laryngeal cancer Hep-2 cells.
【學(xué)位授予單位】：杭州師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.65

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本文編號(hào)：1663695