本文選題：APCM　切入點：組織工程角膜支架　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：角膜疾病占全世界致盲性眼病的第二位,全世界超過1000萬人因為角膜疾病而致盲。目前,對于角膜盲患者來說,角膜移植仍然是唯一確切有效的治療方法。但是因為目前捐獻的角膜材料嚴重缺乏,而使很多因角膜疾病而致盲的患者很難獲得及時而且有效的治療。因角膜供體缺乏,我國每年實施手術(shù)的病人還不到4000例,而每年需行角膜移植的患者卻達到約30萬。在這種情況下,人造角膜替代品成為了當前研究的熱點。人工角膜(Keratoprosthesis)雖然已被批準應用于臨床,但因生物相容性差、術(shù)后并發(fā)癥多,難以在臨床上推廣。組織工程角膜(Tissue-engineered cornea,TECs)角膜是將體外培養(yǎng)的角膜細胞接種于可降解的生物支架材料上構(gòu)建的與天然角膜具有相似的功能和結(jié)構(gòu)的角膜替代物。因為其生物相容性具良好的,而受到了廣泛的關(guān)注。角膜組織工程在近幾十年來研究取得了較大進展。脫細胞豬角膜基質(zhì)(Acellular porcine cornea matrix,APCM)及重組的人膠原在臨床或?qū)嶒瀯游锴鞍鍖咏悄ひ浦仓腥〉昧己眯Ч�。但對于多種角膜疾病來說,如圓錐角膜、角膜穿孔等,穿透性角膜移植仍是廣泛應用的手術(shù)方式。由于傳統(tǒng)觀念的影響,在我國角膜捐獻率較低,而角膜屈光手術(shù)的開展使適于穿透性移植的角膜供體進一步減少。構(gòu)建組織工程全厚角膜植片是解決當前穿透性角膜移植供體不足問題的可行的方法。此外,角膜所包含的細胞類型相對較少,主要有內(nèi)皮細胞、上皮細胞和角膜基質(zhì)細胞。相對于其他器官來說,構(gòu)建TECs角膜更簡單、易行。TECs的兩個關(guān)鍵成分是種子細胞以及其支架材料。脫細胞豬角膜基質(zhì)(Acellular porcine cornea matrix,APCM)具有正常角膜的關(guān)鍵特性,如良好的透明性和生物相容性、與天然角膜相似的力學特性、低免疫原性、可耐受手術(shù)縫合等。對于TECs的構(gòu)建來說,其是一種良好的支架材料。此外,豬角膜來源非常廣泛。所以,在本研究中我們擬選用已經(jīng)脫除了細胞的豬角膜基質(zhì)(脫細胞豬角膜基質(zhì)(Porcine cornea matrix,PCM)作為組織工程全厚角膜的支架。以往文獻報道APCM在基質(zhì)囊袋植入術(shù)后可維持一年不降解,且角膜基質(zhì)細胞在移植術(shù)后3周可遷入其內(nèi)。鑒于此,角膜基質(zhì)細胞在組織工程全厚角膜構(gòu)建中未接種。但豬角膜的厚度大于人角膜,經(jīng)脫細胞程序后,其厚度進一步增加,而植片與植床厚度不匹配可影響角膜移植術(shù)后切口的愈合。因此,在以脫細胞豬角膜為支架的組織工程全厚角膜的構(gòu)建中,如何制備與天然角膜厚度相似的脫細胞豬角膜片層是首先需要解決的問題。種子細胞作為構(gòu)建TECs中的又一關(guān)鍵成分,需要具備來源廣泛、可在體外大量擴增等特點。但原代培養(yǎng)的人角膜上皮和內(nèi)皮細胞增殖能力有限,而經(jīng)基因轉(zhuǎn)染的角膜細胞系具有潛在的致瘤性,限制了其臨床應用。胚胎干細胞(Human embryonic stem cells,hESCs)因具有強大的增殖能力和分化全能性,可向機體三個胚層的細胞分化,近年來成為組織工程中種子細胞的一個重要的來源。在我們前期研究中已建立了人胚胎干細胞在體外向角膜緣上皮樣細胞和角膜內(nèi)皮樣細胞的誘導分化的方法。誘導的角膜緣上皮樣細胞和角膜內(nèi)皮樣細胞與原代培養(yǎng)的細胞具有相似的形態(tài)和功能,可作為TECs的種子細胞的來源。角膜的上皮細胞和內(nèi)皮細胞分別位于角膜前后兩面。因此,為了模擬正常角膜結(jié)構(gòu),建立一個可于支架前后兩面同時培養(yǎng)細胞的三維培養(yǎng)方案也是函待解決的問題。綜上所述,在本研究中,我們首先開發(fā)了一個可制備與天然角膜厚度相似的APCM支架的切割工具。其次,建立了可用于APCM前后兩面同時培養(yǎng)細胞的三維培養(yǎng)方案。并通過該培養(yǎng)方案將胚胎干細胞來源的角膜緣上皮樣(Limbal epithelial cell-like,LEC-like)細胞和角膜內(nèi)皮樣(Corneal endothelial cell-like)細胞作為種子細胞接種于APCM支架嘗試構(gòu)建組織工程全厚角膜,探討該培養(yǎng)方案用于構(gòu)建組織工程全厚角膜的可行性。本研究發(fā)現(xiàn)制備的脫細胞豬角膜支架與天然角膜具有相似的厚度和生物力學特性。以其為支架,通過我們建立的三維培養(yǎng)方案構(gòu)建的組織工程全厚角膜與天然角膜相似,可形成復層的上皮和單層的內(nèi)皮,且分別表達角膜上皮和角膜內(nèi)皮細胞標記物。TECs內(nèi)皮細胞的密度和生物力學特性也與天然角膜相似,并在體內(nèi)表現(xiàn)出一定的功能。但是該植片的透明度與天然角膜相比仍存在一定的差距,還需要在以后的研究中進一步改進。第一部分APCM支架的制備[目的]探討使用我們自行設(shè)計的APCM切割工具制備的APCM片層是否可用作組織工程全厚角膜的支架。[方法]1.豬角膜脫細胞程序:首先新鮮的豬眼球放置于超凈工作臺中,使用含1%青霉素與1%鏈霉素的高溫滅菌的PBS充分洗滌。使用角膜穿刺刀和角膜剪取下角膜,中央11mm的角膜使用環(huán)鉆鉆下,然后使用1.5mol/L的無菌氯化鈉溶液及5U/ml的DNA/RNA酶處理,脫除豬角膜的細胞成分。2.脫細胞豬角膜片層的切割:將脫完細胞的豬角膜置于我們自行設(shè)計的切割工具內(nèi),通過加壓排出脫細胞豬角膜內(nèi)的水分,將切割工具的刻度調(diào)整至400μm,使用薄刀片沿右側(cè)加壓塊切割豬角膜基質(zhì)前板層(如第一部分圖2所示),作為組織工程角膜的支架,-20℃無菌保存?zhèn)溆谩?.APCM支架的生物學特性檢測:HE及DAPI染色檢測APCM支架中細胞脫除情況。免疫熒光法檢測角膜上皮的基底膜成分collagen Ⅳ和laminin的表達,評價經(jīng)脫細胞處理的支架的上皮基底膜是否完整。測量樣品含水量,使用千分尺測量支架的厚度,分光光度計測量支架的透明度,Instron電子拉伸機測量支架的生物力學強度。[結(jié)果]HE和DAPI染色顯示APCM支架內(nèi)未見明顯的細胞以及細胞核內(nèi)物質(zhì)殘留,支架內(nèi)膠原保存完好,無明顯斷裂。免疫熒光染色可在APCM支架前表面檢測到連續(xù)的collagen Ⅳ和laminin表達。APCM支架的厚度和生物力學強度與正常兔角膜相似,含水量略高于正常兔角膜,但透光度略低于正常兔角膜,而經(jīng)甘油脫水后其透光度增加,甚至略高于正常兔角膜。[結(jié)論]高滲鹽聯(lián)合DNA/RNA酶可有效去除豬角膜內(nèi)的細胞成分,并保留了上皮細胞基底膜。切割后的APCM支架與正常兔角膜厚度和生物力學強度相似,可以用作組織工程全厚角膜構(gòu)建的支架材料。第二部分hESCs體外分化為LEC-like和CEC-like細胞的實驗研究[目的]體外誘導hESCs分化為LEC-like細胞和CEC-like細胞,并分選純化ABCG2陽性的LEC-like細胞和N-cadherin陽性的CEC-like細胞。[方法]1.hESCs的培養(yǎng)和表型檢測:將hESCs H1細胞株培養(yǎng)于Matrigel包被的培養(yǎng)板中,使用mmTeSRl培養(yǎng)基進行培養(yǎng),每5天傳代。免疫熒光法檢測hESCs標記物OCT4及SSEA-3的表達。2.人角膜緣上皮細胞和基質(zhì)成纖維細胞的培養(yǎng)和鑒定:(1)角膜緣上皮細胞(Limbal epithelial cells,LECs)培養(yǎng):角膜移植術(shù)后剩余的角膜環(huán)經(jīng)含1%青霉素-鏈霉素的PBS充分沖洗后,顯微鏡下剝除后彈力層,然后置于2.4U/ml的dispase Ⅱ中消化1.5小時,0.25%胰酶-0.02%EDTA消化10分鐘,將消化下來的LECs置于2%去生長因子Matrigel包被的培養(yǎng)皿培養(yǎng)。熒光免疫法檢測LEC細胞的標記物ABCG2、p63及CK3的表達;(2)角膜基質(zhì)成纖維細胞(Corneal stromal fibroblasts,CSFs)培養(yǎng):殘余的組織塊使用剪刀修剪成約1mm3大小,置于0.02%的膠原酶A中繼續(xù)消化2小時,離心后接種于培養(yǎng)皿,使用含胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。熒光免疫法檢測CSF細胞標記物vimentin和α-SMA的表達。3.條件培養(yǎng)基的收集與配制:(1)LEC細胞條件培養(yǎng)基的配制:根據(jù)我們以前研究結(jié)果,將收集的LEC細胞培養(yǎng)基與其原培養(yǎng)基以3:1比例混合作為LEC細胞條件培養(yǎng)基;(2)角膜內(nèi)皮細胞分化培養(yǎng)基的制備:根據(jù)我們以前研究結(jié)果,晶狀體上皮細胞系生長到700%-90%融合時,每12小時收集培養(yǎng)基,與CSF細胞培養(yǎng)基以3:1比例混合作為CEC-like細胞分化培養(yǎng)基。兩種條件培養(yǎng)基均經(jīng)0.22μm濾器過濾除菌后,保存在-80℃冰箱備用。4.體外誘導hESCs分化為LEC-like細胞和CEC-like細胞:(1)hESCs經(jīng)2mg/ml的dispase酶消化后置于低粘附培養(yǎng)皿中,使用擬胚體(Embryoid bodies,EBs)培養(yǎng)基培養(yǎng)形成EBs。(2)按照我們以往報道的方法誘導hESCs分化為LEC-like和CEC-like細胞。LEC-like細胞的誘導:Ⅳ型膠原包被培養(yǎng)板,24孔板每孔中接種10-15個EBs,使用角膜緣上皮細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)9天,誘導其分化為LEC-like細胞。CEC-like細胞的誘導:纖連蛋白、層黏連蛋白以及硫酸軟骨素包被液包被的六孔細胞培養(yǎng)板,每孔接種80個EBs,通過Transwell與CSF細胞共培養(yǎng)5天,隨后去除CSF細胞,使用CEC-like細胞分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周,誘導其分化為CEC-like細胞。5.LEC-like細胞和CEC-like細胞的表型鑒定和純化:(1)LEC-like細胞表型的鑒定和純化:熒光免疫法檢測ABCG2、p63和CK3的表達,流式細胞術(shù)分選ABCG2陽性的細胞,作為LEC-like細胞;(2)CEC-like細胞表型鑒定和純化:免疫熒光法檢測N-cadherin、ZO-1和Na+/K+ATP酶的表達,流式細胞術(shù)分選N-cadherin陽性的細胞作為CEC-like細胞。[結(jié)果]誘導的LEC-like細胞呈鋪路石樣,高表達ABCG2,p63和CK3,與原代培養(yǎng)的LEC細胞相似。誘導的CEC-like細胞呈多邊形,在EBs周圍形成內(nèi)皮細胞單層,CEC細胞標記物N-cadherin、ZO-1和Na+/K+ATP酶熒光免疫染色呈陽性。流式細胞術(shù)分析顯示誘導的LEC-like細胞中ABCG2陽性的細胞約為34.94%,誘導的CEC-like細胞中N-cadherin陽性的細胞約10.91%。流式細胞術(shù)分選的LEC-like 細胞共表達 ABCG2 和 p63,分選的 CEC-like 共表達 N-cadherin、ZO-1和 Na+/K+ ATP 酶。[結(jié)論]我們誘導的LEC-like細胞和CEC-like細胞分別與原代培養(yǎng)的角膜緣上皮細胞和角膜內(nèi)皮細胞表現(xiàn)出相似的形態(tài)和標記物表達。通過細胞分選可獲取純度較高的LEC-like細胞和CEC-like細胞。第三部分組織工程全厚角膜的構(gòu)建和體內(nèi)功能的檢測[目的]探討使用我們建立的三維培養(yǎng)方案構(gòu)建組織工程全厚角膜的可行性,并進一步檢測構(gòu)建的組織工程角膜的生物學特性和體內(nèi)功能,評估其用于穿透性角膜移植(Penetrating keratoplasty,PKP)的可行性。[方法]1.CEC-like細胞和LEC-like細胞的接種:將APCM支架置于我們開發(fā)的培養(yǎng)系統(tǒng)的中空插件內(nèi)(如第三部分圖1所示),基質(zhì)面朝上,將CEC-like細胞按3000/mm2接種于基質(zhì)面,培養(yǎng)兩周。隨后反轉(zhuǎn)構(gòu)建物,使其前彈力層面朝上,然后按照1.5×1 04/mm2的密度接種LEC-like細胞。培養(yǎng)基沒過構(gòu)建物培養(yǎng)1周,隨后改為氣液界面法繼續(xù)培養(yǎng)1周,促進上皮形成復層。2.組織工程角膜形態(tài)及生物學特性檢測:HE染色觀察組織工程角膜的組織形態(tài)。熒光免疫法檢測組織工程角膜上皮及內(nèi)皮標記物的表達。臺盼藍-茜素紅染色,隨后于顯微鏡下計數(shù)內(nèi)皮細胞密度。使用千分尺測量組織工程角膜的厚度,分光光度計測量其的透光度,Instron電子拉伸機測量其生物力學強度。3.穿透性角膜移植:實驗組以組織工程全厚角膜作為植片進行PKP手術(shù)。對照組:以APCM支架為植片,其余操作與實驗組相同。術(shù)后行裂隙燈檢查、眼壓測量以及眼前節(jié)OCT檢查,觀察組織工程角膜植片透明度和厚度變化、角膜新生血管生長及術(shù)后免疫排斥反應。術(shù)后8周行共聚焦激光角膜顯微鏡檢查觀察內(nèi)皮情況。4.組織學觀察:術(shù)后1、2、4和8周分別摘除1只家兔角膜,HE染色觀察術(shù)后組織工程角膜和APCM支架上皮和內(nèi)皮的變化、基質(zhì)細胞長入和浸潤的炎細胞�？谷撕丝贵w追蹤TECs內(nèi)人角膜細胞在移植術(shù)后的變化。免疫熒光法檢測移植術(shù)后TECs上皮及內(nèi)皮標記物的表達。[結(jié)果]1.組織工程全厚角膜生物學特征的體外檢測:HE染色可見構(gòu)建物形成3-4層上皮和單層的內(nèi)皮。免疫熒光染色顯示:在構(gòu)建物上皮層中,角膜上皮細胞標記物CK3呈陽性,部分基底部細胞中角膜緣干細胞標記物ABCG2呈陽性,但未檢測到p63的表達。構(gòu)建物內(nèi)皮中CEC細胞標記物Na+/K+ATP酶、N-cadherin和ZO-1。組織工程角膜與正常兔角膜具有相似的內(nèi)皮細胞密度、厚度和生物力學強度,但透光度略低于正常兔角膜。2.組織工程全厚角膜體內(nèi)功能的檢測:穿透性角膜移植術(shù)后實驗組和對照組角膜植片厚度均增加,術(shù)后1周后,實驗組植片開始變薄,透明度逐漸增加;對照組植片厚度逐漸增加,透明度隨時間延長逐漸下降。2-4周時兩組中家兔的植片中開始出現(xiàn)新生血管,但在對照組中,新生血管生長更快,至術(shù)后8周時新生血管已經(jīng)長滿植片,植片厚度平均為780μm,呈瓷白色,不透明。實驗組至術(shù)后8周時新生血管長入植片邊緣,厚度平均為460μm,透過植片可見虹膜。HE染色示:實驗組植片各時間點均可見上皮和內(nèi)皮細胞覆蓋,對照組至術(shù)后4周時可見上皮細胞覆蓋,但觀察期內(nèi)植片后表面未見內(nèi)皮細胞。術(shù)后2周時兩組植片中均可見炎細胞浸潤,但在觀察期內(nèi)未見炎細胞明顯增加�？谷撕丝贵w染色顯示:實驗組在4周內(nèi)可檢測到抗人核抗體陽性的上皮細胞。術(shù)后8周時在植片上皮中未檢測到抗人核抗體陽性的細胞,但在內(nèi)皮還可以檢測到抗人核抗體陽性的細胞,而對照組中沒有檢測到抗人核抗體陽性的細胞。免疫熒光染色顯示:術(shù)后4周時,移植的組織工程角膜上皮中可檢測到抗人CK3抗體染色陽性的細胞,但未檢測到人ABCG2和p63的表達。術(shù)后8周時抗人CK3陽性的細胞消失,但在植片內(nèi)皮面仍可檢測到表達人角膜內(nèi)皮細胞標記物的細胞。[結(jié)論]我們建立的三維培養(yǎng)方案可用于組織工程全厚角膜的構(gòu)建,構(gòu)建的角膜與天然角膜具有相似的內(nèi)皮細胞密度、厚度和生物力學強度。在體內(nèi),組織工程全厚角膜也表現(xiàn)出一定的天然角膜的生物學功能,且免疫排斥反應并不重,但其透明度仍低于天然角膜。如何提高構(gòu)建的組織工程全厚角膜在體內(nèi)的透明度還需要在以后的實驗中再進一步研究。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R779.65;R318.08
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本文編號：1651650