本文選題：視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞　切入點(diǎn)：白細(xì)胞介素-6　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分：眼視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中蛋白酶體抑制劑MG-132通過(guò)活化P38MAPKs細(xì)胞信號(hào)通路促進(jìn)了白細(xì)胞介素-6的表達(dá) 目的 老年性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）隨著年齡的增長(zhǎng)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，近年來(lái)在防治老年性黃斑變性的研究中眼視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinal pigment epithelium，RPE）功能的變化成為研究熱點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)老齡化的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中蛋白酶體（proteasome）的活性逐漸下降，并且許多研究顯示炎癥細(xì)胞因子（inflammatory cytokines）在老年黃斑變性的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）是其中重要的一種細(xì)胞因子。本章我們用抑制蛋白酶體活性的試劑MG-132來(lái)模擬年齡增長(zhǎng)所導(dǎo)致的蛋白酶體活性下降的這一自然現(xiàn)象，從而更好地研究蛋白酶體的活性下降對(duì)眼視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子IL-6的影響及作用機(jī)制。 方法 我們先將人RPE細(xì)胞系（ARPE-19）分成兩組培養(yǎng)，一組只加DMEM（其內(nèi)含10%FBS，100U/ml penicillin G和100μg/ml streptomycin），另一組加DMEM（內(nèi)含成分同上）和10μM MG132，然后分別在2小時(shí)，4小時(shí)，6小時(shí)，8小時(shí)，10小時(shí)，12小時(shí)等時(shí)間點(diǎn)，首先收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（mono-cytechemo-attractant protein-1，MCP-1）的含量。再收集1小時(shí)，4小時(shí)，8小時(shí)等時(shí)間點(diǎn)的RPE細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time polymerase chainreaction，Real-time PCR）測(cè)IL-6的mRNA（Messenger Ribonucleic Acid，信使核糖核酸）含量。然后我們用蛋白質(zhì)印跡法（Western-blotting法，WB法）和電泳凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）測(cè)定MG-132是否可以激活調(diào)控IL-6分泌的兩條主要細(xì)胞信號(hào)通路P38-絲裂原激活的蛋白激酶途徑（P38Mitogen-Activated Protein Kinases，P38MAPKs）和c-Jun氨基端激酶（c-JunN-terminal Kinase, JNK，另一條重要的MAPKs）。再在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM中加入這些細(xì)胞信號(hào)通路的抑制劑，用ELISA方法測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的含量，以便于觀察哪個(gè)信號(hào)通路的抑制劑可以抵消MG-132促進(jìn)IL-6分泌的作用。 結(jié)果 蛋白酶體抑制劑MG132增加了視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞IL-6的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，卻降低了MCP-1的分泌。MG132可以激活調(diào)控IL-6分泌的兩條主要細(xì)胞信號(hào)通路P38MAPKs和c-Jun氨基端激酶。P38MAPKs的抑制劑-SB203580加入RPE培養(yǎng)液后不僅可以降低視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的基礎(chǔ)分泌，而且可以抵消MG-132促進(jìn)IL-6分泌的作用；而當(dāng)加入JNK的抑制劑-SP600125后，雖然也可以降低IL-6的基礎(chǔ)分泌，但卻不能抵消MG-132促進(jìn)IL-6分泌的作用。 結(jié)論 在眼視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中，蛋白酶體活性的抑制劑MG132可以通過(guò)激活P38MAPKs細(xì)胞信號(hào)通路來(lái)促使IL-6的產(chǎn)生。 第二部分：在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎中CD4+T淋巴細(xì)胞上死亡受體-3表達(dá)的增加促進(jìn)了白細(xì)胞介素-17的分泌 目的 目前大量臨床及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)資料表明死亡受體-3（Death Receptor3，DR3，又名腫瘤壞死因子受體超家族-25，Tumor necrosis factor receptor super-family-25,TNFRSF-25）在自身免疫性疾�。╝utoimmune diseases）中發(fā)揮了重要作用。葡萄膜炎（uveitis）是眼科常見(jiàn)的一種自身免疫性疾病，以前認(rèn)為CD4+T淋巴細(xì)胞（CD4~+T cells）產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-12（Interleukin-12，IL-12）\干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）免疫細(xì)胞因子通路在葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展中起著主要作用，但現(xiàn)在的研究表明白細(xì)胞介素-23（Interleukin-23，IL-23）\白細(xì)胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）免疫因子通路發(fā)揮了更為重要的作用。我們主要研究了在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU）中，CD4+T淋巴細(xì)胞上死亡受體-3的量的變化及其與IL-17的關(guān)系。 方法 通過(guò)在小鼠的足底皮下注射200μl光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白161-180（interphotoreceptor retinoid-binding protein161-180，IRBP161-180）與完全弗氏佐劑（Complete Freund’s adjuvant，CFA）的混合物誘導(dǎo)了小鼠B10.RIII的自身免疫性葡萄膜炎的動(dòng)物模型，并對(duì)其進(jìn)行臨床及眼組織病理學(xué)方面的觀察及評(píng)分。實(shí)驗(yàn)中，，將小鼠分為三組：①對(duì)照組（Control group，CONT），即足底皮下注射200μl磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）和完全弗氏佐劑的乳化混合物，②實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎組（experimental autoimmune uveitis group，EAU），即小鼠的足底皮下注射200μl光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白與完全弗氏佐劑的混合物，③已恢復(fù)組（recovery phase mice group，Recovery），即注射光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白與完全弗氏佐劑的乳化混合物后的4至5周以后，也就是眼內(nèi)炎癥已經(jīng)完全消退的小鼠。然后處死小鼠收集其淋巴結(jié)（draining lymph nodes，DLNs），一部分淋巴結(jié)提取總蛋白，用蛋白質(zhì)印跡法（Western-blotting，WB）測(cè)其中腫瘤壞死因子配體相關(guān)分子-1A （Tumor necrosis factor ligand associatedmolecular-1A，TL1A，即DR3的配體，又名腫瘤壞死因子超家族-15，Tumor necrosisfactor super-family-15，TNFSF-15）的含量，另一部分淋巴結(jié)在無(wú)菌條件下分離出淋巴細(xì)胞后，用磁珠細(xì)胞分選的方法分離出CD4+T cells。與此同時(shí)，一些CD4+Tcells被分為兩組，一組細(xì)胞培養(yǎng)液1640中加入重組的TL1A和抗CD3與抗CD28的抗體，另一組培養(yǎng)液中不加TL1A，只加抗CD3與抗CD28的抗體，刺激3天后收集上清，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA）測(cè)IL-17的含量。另一些CD4~+T cells被提取總蛋白和mRNA（Messenger RibonucleicAcid，信使核糖核酸），分別用蛋白質(zhì)印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（Real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR）測(cè)細(xì)胞中DR3的含量。 結(jié)果 臨床和組織病理學(xué)結(jié)果顯示，被光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白161 180與完全弗氏佐劑的乳化混合物免疫的小鼠產(chǎn)生了嚴(yán)重的眼內(nèi)炎癥，在誘導(dǎo)14天后炎癥達(dá)到高峰，4-5周以后眼內(nèi)炎癥完全消退。CD4~+T cells中DR3的mRNA和蛋白質(zhì)水平在對(duì)照組和已恢復(fù)組中的含量相似，但在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎小鼠組（7或14天）要高于對(duì)照組和已恢復(fù)組，而21天的EAU組CD4~+T cells中DR3的mRNA水平和蛋白質(zhì)含量和其他兩組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。老鼠淋巴結(jié)中DR3的配體TL1A的含量在EAU（14天）組中最多，明顯高于對(duì)照組和已恢復(fù)組，而后兩組中TL1A的含量無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外，TL1A能促進(jìn)CD4~+T cells產(chǎn)生IL-17，更重要的是相對(duì)于其他兩組，EAU（14天）組的CD4~+T cells被TL1A刺激后可以產(chǎn)生更多的IL-17，而對(duì)照組和已恢復(fù)組的CD4~+T cells被刺激后增加的IL-17的量相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論 在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎的疾病過(guò)程中，死亡受體-3的含量在被完全弗氏佐劑與光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白161-180的乳化混合物免疫的小鼠14天時(shí)，即老鼠眼內(nèi)炎癥最重時(shí)最多，之后其含量逐漸減少到和對(duì)照組小鼠相似的水平，其量的變化可能影響了小鼠CD4~+T cells分泌IL-17，從而參與了EAU的發(fā)生發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R774.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 張歆;任百超;;年齡相關(guān)性黃斑變性的治療研究新進(jìn)展[J];國(guó)際眼科雜志;2007年06期

2 閆焱;王玲;;年齡相關(guān)性黃斑變性治療新進(jìn)展[J];國(guó)際眼科雜志;2008年05期

3 李娟;胡永華;;年齡相關(guān)性黃斑變性的病因研究[J];國(guó)際眼科雜志;2008年10期

4 倪曉光;趙平;;泛素-蛋白酶體途徑的組成和功能[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2006年03期

5 楊培增,鐘華紅;葡萄膜炎研究新進(jìn)展──國(guó)際眼內(nèi)炎癥專題會(huì)議概況[J];眼科研究;2001年05期

6 Bernd Kirchhof,張虹;老年性黃斑變性[J];The Chinese-German Journal of Clinical Oncology;2000年06期

7 楊培增,張震,王紅,周紅顏,黃祥坤,李兵;葡萄膜炎的臨床類型及病因探討[J];中華眼底病雜志;2002年04期

8 楊培增;葡萄膜炎的診斷及相關(guān)問(wèn)題[J];中華眼科雜志;2002年04期

9 黃叔仁;老年性黃斑變性[J];實(shí)用眼科雜志;1992年07期

10 祝錦霞,趙東生;老年性黃斑變性[J];眼科研究;1987年04期

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