本文選題：阿帕替尼　切入點：脈絡膜新生血管　出處：《揚州大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分:阿帕替尼對激光誘導的小鼠脈絡膜新生血管的抑制作用目的:觀察阿帕替尼對激光誘導的小鼠脈絡膜新生血管形成的抑制作用。方法:60只6-8周齡雄性C57BL/6小鼠,隨機分為4組,每組15只,即正常對照組及實驗組(生理鹽水組、低劑量阿帕替尼組和高劑量阿帕替尼組)。實驗組構(gòu)建激光誘導的小鼠CNV模型,均為右眼。建模后即采用灌胃的方式,實驗組分別給予生理鹽水、低、高劑量的阿帕替尼治療7d;建模后第7d分別采用熒光素眼底血管造影(FFA)觀察各組脈絡膜新生血管區(qū)面積及滲漏變化;行脈絡膜鋪片進一步測量新生血管區(qū)面積的大小并作組織病理學檢查。結(jié)果:(1)FFA結(jié)果顯示:與正常對照組比較,生理鹽水組可見大面積脈絡膜新生血管區(qū)形成,證明造模成功。對每組各只小鼠激光點的滲漏等級進行評分,組間總體差異有統(tǒng)計學意義(F=51.76;P=0.000);其中,生理鹽水組的滲漏評分為(8.43±0.50)分,低劑量阿帕替尼組的滲漏評分為(7.84±0.50)分,高劑量阿帕替尼組的滲漏評分為(6.13±0.90)分。與對照組比較,低劑量阿帕替尼組及高劑量阿帕替尼組滲漏評分顯著降低(P=0.020;P=0.000),且高劑量阿帕替尼組較低劑量阿帕替尼組熒光滲漏評分低(P=0.000)。(2)脈絡膜鋪片結(jié)果顯示:正常小鼠脈絡膜鋪片中視網(wǎng)膜色素上皮細胞被F-actin染色呈現(xiàn)規(guī)則的六邊形結(jié)構(gòu);脈絡膜鋪片新生血管面積組間總體差異有統(tǒng)計學意義(F=143.72;P=0.001);生理鹽水組被激光破壞掉的視網(wǎng)膜色素上皮層區(qū)域可見IB4標記的呈輻射狀脈絡膜新生血管區(qū)域,其脈絡膜新生血管區(qū)的面積為(100.00±6.00)μm2;阿帕替尼干預組中可見IB4標記的脈絡膜新生血管區(qū)面積明顯減小,其中高劑量阿帕替尼組新生血管區(qū)面積為(28.00±4.00)μm2,低劑量阿帕替尼組新生血管區(qū)面積(66.88±8.41)μm2,兩組新生血管區(qū)面積與生理鹽水組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.001),高劑量組小于低劑量組新生血管區(qū)面積,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。(3)對新生血管區(qū)域行HE染色,結(jié)果顯示:組間總體差異有統(tǒng)計學意義(F=1899;P=0.000);與正常對照組比較,生理鹽水組有明顯的新生血管形成,且長度和厚度分別為(392.86±3.54)μm和(96.05±6.58)μm,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000);而與生理鹽水組比較阿帕替尼組損傷區(qū)新生血管的長度和厚度明顯減少,其中低劑量阿帕替尼組長度為(164.99±8.24)μm、厚度為(62.68±3.81)μm,高劑量阿帕替尼組長度為(81.16±6.53)μm、為厚度(25.58±4.02)μm,與生理鹽水組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.000);且高劑量阿帕替尼組與低劑量阿帕替尼組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。結(jié)論:阿帕替尼對激光誘導的小鼠CNV具有一定的抑制作用。第二部分:阿帕替尼對HRMEC增殖、遷移、管腔形成的影響及其分子機制的研究目的:探討阿帕替尼對HRMEC的增殖、遷移、管腔形成的影響及其分子機制。方法:體外培養(yǎng)HRMEC,實驗分組:對照組、rhVEGF誘導組、rhVEGF+5μM阿帕替尼組和rhVEGF+1μM阿帕替尼組。分別予以上述不同的干預后,檢測各組細胞的增殖、遷移及管腔形成情況;Western blotting檢測阿帕替尼對細胞p-VEGFR2、VEGFR2、ZO-1以及Occludin表達水平的影響。結(jié)果:(1)阿帕替尼抑制rhVEGF誘導的HRMEC增殖活性:CCK-8實驗表明,與對照組比較,隨著阿帕替尼濃度的增加,細胞增殖活性逐漸降低,分別為0.05μM(96.8%)、0.1μM(84.5%)、0.2μM(74.2%)、0.4μM(63.5%)、0.8μM(56.0%)、1.6μM(45.5%)、3.2μM(42.0%)、6.4μM(35.6%),因此,阿帕替尼可以一定程度上抑制rhVEGF誘導的HRMEC增殖活性,并呈劑量依賴性(P0.05)。(2)遷移實驗顯示,遷移細胞數(shù)量組間總體差異有統(tǒng)計學意義(F=119.30;P=0.000);與對照組細胞遷移數(shù)量(64.00±5.57個)相比,rhVEGF組細胞遷移數(shù)量(97.00±4.35個)顯著增加(P=0.000);在rhVEGF誘導的同時加入高低劑量的阿帕替尼后,在rhVEGF+5μM阿帕替尼組細胞遷移數(shù)量為(32.00±4.00個),rhVEGF+1μM阿帕替尼組細胞遷移數(shù)量為(44.67±3.51個),其中與rhVEGF組比較,rhVEGF+1μM阿帕替尼組細胞遷移數(shù)量顯著減少(P=0.000),且rhVEGF+5μM阿帕替尼組比rhVEGF+1μM阿帕替尼組抑制細胞遷移的數(shù)量更明顯(P=0.035)。(3)阿帕替尼抑制HRMEC閉合管腔的形成:管腔形成實驗結(jié)果顯示,各組間總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=112.10;P=0.000);與對照組中閉合的管腔數(shù)量(10.33±0.58)個/孔相比,rhVEGF誘導組的管腔形成數(shù)量(17.00±1.00個/孔)明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000);在加入rhVEGF誘導的同時加入阿帕替尼干預后,在rhVEGF+5μM阿帕替尼組管腔形成數(shù)量為(4.00±1.00)個/孔,rhVEGF+1μM阿帕替尼組管腔形成數(shù)量為(7.00±1.00)個/孔,與rhVEGF組比較rhVEGF+阿帕替尼組兩組管腔形成數(shù)量均顯著減少(P=0.000),其中rhVEGF+5μM阿帕替尼組比rhVEGF+1μM阿帕替尼組抑制管腔形成的數(shù)量更明顯(P=0.016)。(4)阿帕替尼抑制HRMEC中VEGFR2和p-VEGFR2的表達,促進緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達:Western blot結(jié)果顯示,對照組VEGFR2、p-VEGFR2、ZO-1和Occludin灰度值分別為 0.29±0.02、0.28±0.02、0.29±0.02、0.23±0.01;rhVEGF 刺激組 VEGFR2、p-VEGFR2、ZO-1和Occludin灰度值分別為:0.52±0.04、0.56±0.04、0.11±0.003和0.08±0.002;低劑量阿帕替尼處理組VEGFR2、p-VEGFR2、ZO-1和Occludin灰度值分別為:0.26±0.02、0.20±0.002、0.54±0.02、0.41±0.02;高劑量阿帕替尼處理組 VEGFR2、p-VEGFR2、ZO-1 和 Occludin 灰度值分別為:0.17±0.01、0.06±0.004、0.54±0.02、0.61± 0.04。四種蛋白間總體比較結(jié)果顯示:VEGFR2(F=110.35;P=0.001)、p-VEGFR(F=274.98;P=0.000)、ZO-1(F=556.74;P=0.000)和 Occludin(F=338.49;P=0.000);與對照組相比,rhVEGF刺激后的細胞組VEGFR2(P=0.001)和p-VEGFR2(P=0.000)增加;而緊密連接蛋白ZO-1(P=0.000)和Occludin(P=0.000)表達水平均降低;而加阿帕替尼干預后,與rhVEGF組比較,VEGFR2(P=0.000)和p-VEGFR2(P=0.000)表達均下降;而緊密連接蛋白ZO-1(P=0.000)和Occludin(P=0.000)表達水平均增加。結(jié)論:阿帕替尼可以抑制HRMEC的增殖、遷移及管腔形成,并抑制VEGFR2、p-VEGFR2的表達,但促進ZO-1和Occludin表達。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R774

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本文編號：1627806