本文選題：鼻咽癌　切入點(diǎn)：microRNA　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景腫瘤分子標(biāo)志物的研究伴隨了腫瘤研究的整個(gè)歷程,一直是腫瘤研究經(jīng)久不衰的課題。理想的腫瘤分子標(biāo)志物應(yīng)具有以下幾個(gè)特征：1、樣本容易并且可重復(fù)獲得；2、可用于早期診斷；3、可預(yù)測(cè)腫瘤的治療敏感性；4、可預(yù)測(cè)預(yù)后；5、可監(jiān)測(cè)療效,提示復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,以便及時(shí)調(diào)整治療方案。由于外周血檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)、可重復(fù)、可于同一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo)等優(yōu)點(diǎn),一直是腫瘤分子標(biāo)志物研究的方向。以往的研究發(fā)現(xiàn)基因、蛋白的改變特異性較差,同時(shí)基因或蛋白的改變主要集中于腫瘤細(xì)胞,由于蛋白質(zhì)分子量較大,運(yùn)輸至細(xì)胞外,尤其是血液或體液中較晚,很難在早期從血液樣本或體液中得到變化結(jié)果,極難重復(fù)獲得,也就難以成為理想的腫瘤分子標(biāo)志物。MicroRNA (miRNA)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類大小約為18～25個(gè)核苷酸(nucleotide, nt)的非編碼單鏈小分子RNA,通過(guò)與靶基因mRNA的3’非編碼區(qū)(3' untranslated region,3'UTR)不完全互補(bǔ)配對(duì),在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)。目前研究表明50%以上的miRNA定位在腫瘤相關(guān)基因組區(qū)域(包括雜合子缺失區(qū)、染色體擴(kuò)增區(qū)和脆性位點(diǎn)等),不但扮演原癌基因或抑癌基因的角色,還通過(guò)多條信號(hào)通路調(diào)控腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,廣泛的參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。由于miRNA幾乎參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展中的每一個(gè)步驟,在腫瘤發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了超乎想象的重要作用,因此miRNA在腫瘤的臨床診斷、分型、治療及預(yù)后判斷等方面均存在良好的臨床應(yīng)用前景。相對(duì)于腫瘤組織miRNA差異表達(dá)的研究,以血漿為代表的體液miRNA研究顯示了更佳的應(yīng)用前景,自2008年首次報(bào)道了1miRNA在腫瘤血漿中的表達(dá)譜與正常人相比存在顯著差異,開(kāi)啟了血漿miRNA作為腫瘤分子標(biāo)志物研究的先河,為血漿miRNA作為腫瘤分子標(biāo)志物臨床應(yīng)用的研究開(kāi)創(chuàng)了一個(gè)廣闊的領(lǐng)域。正常情況下血漿中存在miRNA,可能為細(xì)胞、組織、器官之間的信息傳遞方式,普通正常人群的血漿miRNA表達(dá)譜變化不大,多數(shù)來(lái)源于血小板及單核細(xì)胞,通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示正常人群血漿中絕大多數(shù)miRNA的功能為調(diào)節(jié)細(xì)胞分化與代謝,小部分調(diào)節(jié)免疫功能,目前基本公認(rèn)血漿中miRNA主要由細(xì)胞分泌微泡釋放入血,意義在于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),傳遞生物信息。腫瘤細(xì)胞也可通過(guò)微泡主動(dòng)釋放miRNA入血,隨之其表達(dá)譜可發(fā)生變化,由于血漿中miRNA分子量小且被微泡保護(hù),穩(wěn)定性好,重復(fù)性高,研究表明細(xì)胞外miRNA在系統(tǒng)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)中起著重要的聯(lián)系和調(diào)節(jié)作用,早于基因及蛋白的變化,其發(fā)生也早于細(xì)胞惡變、轉(zhuǎn)移,可能與腫瘤發(fā)病、轉(zhuǎn)移、免疫耐受、特異性器官轉(zhuǎn)移有關(guān)。血漿miRNA作為腫瘤分子標(biāo)志物有以下優(yōu)點(diǎn)：1、腫瘤病人血漿miRNA表達(dá)譜有明顯異常并且有組織特異性趨勢(shì)；2、在血漿中穩(wěn)定；3、樣本容易且可反復(fù)獲得；4、miRNA發(fā)生早于基因及蛋白的變化,容易早期發(fā)現(xiàn)。目前針對(duì)miRNA作為腫瘤分子標(biāo)志物的研究剛剛起步,鑒于血液樣本較組織標(biāo)本容易且可反復(fù)獲得,同時(shí)血漿miRNA作為腫瘤分子標(biāo)志物具有以上種種優(yōu)勢(shì),所以以血漿miRNA將有可能為腫瘤分子標(biāo)志物的研究帶來(lái)曙光,其臨床應(yīng)用意義前景廣闊。目前血漿miRNA在腫瘤的研究集中在大腸癌、乳腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、頭頸腫瘤等腫瘤中,并且已初步驗(yàn)證血漿miRNA作為診斷及預(yù)后指標(biāo)的可行性,顯示了良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國(guó)南方地區(qū)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,以明顯的區(qū)域分布特征、強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)移傾向、與愛(ài)波斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)感染的密切關(guān)系為顯著特征。大宗臨床病例觀察顯示鼻咽癌病人不易早期發(fā)現(xiàn)。而有關(guān)鼻咽癌的分子標(biāo)志物研究中,EB病毒VCA-IgA、EA-IgA及血液中EBV-DNA拷貝數(shù)變化雖然在一定程度上可監(jiān)測(cè)鼻咽癌療效,但目前還沒(méi)有被FDA承認(rèn)的鼻咽癌診斷及預(yù)測(cè)預(yù)后的分子標(biāo)志物。如何能夠早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)測(cè)腫瘤對(duì)治療的敏感性、預(yù)測(cè)預(yù)后、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移對(duì)鼻咽癌診治療具有及其重要的臨床意義。盡管近幾年來(lái)陸續(xù)有研究報(bào)道m(xù)iRNA參與鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制,但與歐美高發(fā)的乳腺癌和前列腺癌研究相比仍是九牛一毛,更為重要的是,僅有的一些鼻咽癌1miRNA研究多數(shù)集中于基礎(chǔ)研究,少數(shù)使用了小樣本的組織標(biāo)本進(jìn)行研究,臨床意義較小,鑒于血漿miRNA在腫瘤分子標(biāo)志物研究中的良好應(yīng)用前景,而目前尚無(wú)鼻咽癌血漿miRNA的研究報(bào)道,本課題利用從2007年開(kāi)始收集的大宗鼻咽癌病人血標(biāo)本,結(jié)合詳細(xì)臨床資料及隨訪對(duì)血漿miRNA在鼻咽癌的臨床應(yīng)用價(jià)值展開(kāi)初步探討。材料和方法1、臨床病例資料2007年12月～2011年6月在南方醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科住院的初診鼻咽癌病人217例,所有病例均經(jīng)過(guò)病理學(xué)檢查確診,鼻咽癌組織學(xué)分型為非角化性未分化型癌或非角化性分化型癌,所有患者均尚未接受放化療治療。完善相關(guān)檢查后依據(jù)鼻咽癌2008分期完成全部病例TNM分期及臨床分期。血漿EBV-DNA定量檢測(cè)由我院檢驗(yàn)科基因檢測(cè)室測(cè)定,治療標(biāo)準(zhǔn)參照V.2.2008NCCA鼻咽癌治療指南進(jìn)行,誘導(dǎo)化療療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)采用頸部化療前后淋巴結(jié)縮小率評(píng)估,化療副反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)按照WHO抗癌藥物急性及亞急性毒性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定,消化系統(tǒng)反應(yīng)按0級(jí)分級(jí),血常規(guī)以白細(xì)胞化療前后差值衡量。全部病人跟蹤隨訪,復(fù)診時(shí)行電子鼻咽鏡及影像學(xué)檢查評(píng)估治療效果,在抽血查EBV-DNA定量同時(shí)取得病人知情同意下再次留取血標(biāo)本,共計(jì)有41例病例有復(fù)診血標(biāo)本。2、血標(biāo)本收集全部患者抽取6～8mlEDTA抗凝全血,同期住院的慢性化膿性中耳炎或慢性鼻竇炎病人73例作為對(duì)照,所有患者均簽署知情同意書(shū)一份。本研究通過(guò)美國(guó)NIH下屬ClinicalTrials.gov臨床試驗(yàn)注冊(cè)審查批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào)NCT01171235,并通過(guò)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。3、血漿標(biāo)本分離與保存參考863課題(鼻咽癌的分子分型和個(gè)體化診療,課題號(hào)2006AA02A404)臨床病人血標(biāo)本收集指南,在4個(gè)小時(shí)內(nèi)分離白細(xì)胞及血漿后于-80℃低溫冰箱保存并由專人負(fù)責(zé)登記。4、熒光定量PCR檢測(cè)抽提血漿總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,U6 snRNA為內(nèi)參照,Cel-miR-39為陽(yáng)性對(duì)照,H2O為陰性對(duì)照,篩查21個(gè)血漿miRNA表達(dá)情況,采用sybr green法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過(guò)相對(duì)定量以2-△△Ct值代表miRNA的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析血漿EBV-DNA與性別、化療消化道副反應(yīng)、T、N、M、臨床分期,化療消化道副反應(yīng)與化療方案采用多(兩)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)；誘導(dǎo)化療前后頸部淋巴結(jié)縮小率及白細(xì)胞下降量采用單因素方差分析,多重分析采用LSD法；兩組間年齡采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；性別采用,檢驗(yàn)；以△Ct作為血漿miRNA統(tǒng)計(jì)指標(biāo),兩組間采用協(xié)方差分析,性別之間以及EBV-DNA按陰性及陽(yáng)性分為兩組后5個(gè)血漿miRNA差異均采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；5個(gè)血漿miRNA與年齡、化療前后淋巴結(jié)縮小率、化療前后WBC變化相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析；5個(gè)血漿miRNA與T、N、M及臨床分期采用多(兩)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)；Spearman非參數(shù)相關(guān)分析5個(gè)血漿miRNA與鼻咽癌病人的T、N、M及臨床分期相關(guān)性及與血漿EBV-DNA、化療消化道副反應(yīng)的相關(guān)性；采用Cox回歸進(jìn)行生存分析；ROC曲線分析5個(gè)血漿miRNA的單獨(dú)診斷效率,以是否患病為應(yīng)變量,以5個(gè)miRNA表達(dá)水平為自變量,進(jìn)行二分類Logistic回歸,建立回歸模型,以預(yù)測(cè)概率與是否患病制作ROC曲線分析診斷效率。治療前后5個(gè)血漿miRNA表達(dá)變化采用配對(duì)t檢驗(yàn),按是否生存采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1、臨床資料部分(1)217例鼻咽癌男：女為2.19：1,最大77歲,最小17歲,平均年齡45.93±11.78歲；(2)采用鼻咽癌2008分期,其中Ⅰ期10例,Ⅱ期52例,Ⅲ期69例,Ⅳ期86例(17例M1)；(3)血漿EBV-DNA定量陽(yáng)性率61.7%,男性病人血漿EBV-DNA陽(yáng)性率較女性高,血漿EBV-DNA隨T、N、M分期及臨床分期增高而含量增加；(4)PF+恩度較PF及TP方案對(duì)頸部淋巴結(jié)縮小率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,TPF+泰新生較TP方案對(duì)頸部淋巴結(jié)縮小率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,雖然TPF方案較TP、PF方案縮小率有所提高,但可能由于樣本量不足以及組間樣本量差別較大,導(dǎo)致無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P分別為0.063、0.292),不同誘導(dǎo)化療方案對(duì)造血系統(tǒng)副作用及消化道副反應(yīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,女性病人化療消化道反應(yīng)較男性高。2、血漿miRNA篩查結(jié)果(1)篩查21個(gè)血漿miRNA的相對(duì)表達(dá)水平,最終結(jié)果miR-16、miR-21、 miR-24、miR-155、miR-378表達(dá)差異在4.05～10倍之間并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；(2)血漿miR-21與T分期呈負(fù)相關(guān),提示血漿miR-21可能為鼻咽癌早期表達(dá)的miRNA分子；血漿miR-16、miR-21、miR-24與N分期呈負(fù)相關(guān)性,提示血漿miR-16、miR-21、miR-24可能為鼻咽癌早期轉(zhuǎn)移表達(dá)的miRNA分子；(3)血漿EBV-DNA與血漿miR-16、miR-21、miR-24、miR-155呈負(fù)相關(guān),提示該4個(gè)血漿miRNA可能與血漿EBV存在相互調(diào)控；(4)5個(gè)血漿miRNA表達(dá)量與本組鼻咽癌病人誘導(dǎo)化療療效及副反應(yīng)無(wú)相關(guān)性；(5)Cox回歸生存分析提示5個(gè)血漿miRNA表達(dá)量與病人生存狀態(tài)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但由于本組病例絕大部分病人隨訪時(shí)間不到3年,結(jié)果有待進(jìn)一步完善；(6)ROC曲線提示5個(gè)指標(biāo)診斷效率均較好,其中血漿miR-21及miR-155最好,曲線下面積達(dá)到0.792及0.763,靈敏度及特異性均分別達(dá)到0.75及0.7；聯(lián)合5個(gè)血漿miRNA或除miR-16的4個(gè)指標(biāo)聯(lián)合可顯著提高診斷效率,曲線下面積達(dá)到0.909,靈敏度及特異性均分別達(dá)到0.877及0.802。3、隨訪情況(1)217例病人隨訪1～40個(gè)月,隨訪率82%,41例有治療前后自身對(duì)照血標(biāo)本,其中5例復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。(2)無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的病例治療后血漿miR-16、miR-21、miR-24、miR-155含量較治療前顯著下降(P0.05)；(3)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移病例血漿miR-21、miR-24、miR-155表達(dá)量均上升,無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移病例miR-378治療后血漿表達(dá)量均明顯上升,復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移病例血漿表達(dá)量下降,顯示了與病情基本一致的變化趨勢(shì)。結(jié)論1. 鼻咽癌不易早期發(fā)現(xiàn),血漿EBV-DNA陽(yáng)性率較低,但隨T、N、M分期及臨床分期增高而含量增加。2. 新型抗血管生成及分子靶向藥物在不增加毒副作用的前提下顯示了良好的抗腫瘤效果。3. 與正常人比較,鼻咽癌病人血漿miR-16、miR-21、miR-24、miR-155、miR-378表達(dá)存在差異。4. 血漿miR-21可能為鼻咽癌早期表達(dá)的miRNA分子；血漿miR-16、miR-21、miR-24可能為鼻咽癌早期轉(zhuǎn)移表達(dá)的miRNA分子5. ROC曲線顯示5個(gè)指標(biāo)單獨(dú)診斷效率均較好,聯(lián)合5個(gè)或排除miR-16的4個(gè)指標(biāo)聯(lián)合可顯著提高診斷效率。6. 本組鼻咽癌病人治療后血漿miR-21、miR-24、miR-155、miR-378動(dòng)態(tài)變化顯示了與病情基本一致的變化趨勢(shì),提示用于監(jiān)測(cè)療效的可能性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.63

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