發(fā)布時間：2018-03-03 13:53

  本文選題：Leber遺傳性視神經(jīng)病變　切入點：線粒體DNA突變　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景： Leber遺傳性視神經(jīng)病變(Leber's Hereditary Optic Neuropathy, LHON)是-種因線粒體功能障礙所導(dǎo)致的母系遺傳疾病,病變主要累及視盤黃斑束神經(jīng)纖維。該病以雙眼急性或亞急性中央視力喪失為主要特征,發(fā)病人群主要為年輕或成年男性。1871年,德國眼科醫(yī)生Theodor Leber對16個家系的55例患者,進(jìn)行調(diào)查研究后,首先報告了LHON病的臨床特征,同時確認(rèn)該病為一種獨立的遺傳性疾病。在疾病早期,患者大多表現(xiàn)為眼底視神經(jīng)炎,所以稱之為Leber視神經(jīng)炎；但經(jīng)過較長病程后,后期患者常表現(xiàn)為視神經(jīng)萎縮,因此該病又被稱為Leber視神經(jīng)萎縮。LHON病的病理機(jī)制迄今為止并未完全闡明,先后有人提出X-連鎖隱性遺傳、常染色體顯性遺傳等觀點,但均不能合理得解釋LHON家系的發(fā)病特點和遺傳規(guī)律。后來細(xì)胞質(zhì)遺傳學(xué)說較好的解釋了該病的發(fā)病特點。1988年Wallace找到了細(xì)胞質(zhì)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),即線粒體DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)突變,并首先報告了第一個與LHON相關(guān)的線粒體DNA突變位點11778, Wallace對9個家系進(jìn)行了分子生物學(xué)檢測研究后,證實了此位點位于ND4基因,并明確了線粒體DNA突變與LHON病的密切關(guān)系,從此為研究LHON的發(fā)病機(jī)制開辟了新的方向。人類完整的線粒體DNA (mtDNA)為一個包含有16569個堿基對的環(huán)狀DNA分子,能夠自我復(fù)制,是獨立于核染色體之外的一個遺傳系統(tǒng)。線粒體DNA的2條鏈,所含的堿基成分不盡相同,一條為輕鏈,另外一條為重鏈,但都具有基因編碼功能：共編碼2類rRNA、22種tRNA以及包含13條多肽鏈的mRNA(即細(xì)胞色素-B、-C,氧化酶的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞單位,ATP酶亞單位-6、-8,以及NADH脫氧酶的7個亞單位：ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6、 ND4L)。由此可見,線粒體DNA的編碼基因突變,必然導(dǎo)致細(xì)胞的氧化磷酸化過程發(fā)生障礙,導(dǎo)致細(xì)胞供能不足。在Wallace的研究基礎(chǔ)上,1991年HuoponenK等對3個芬蘭家系研究后,發(fā)現(xiàn)了位于ND1基因的3460突變位點；Johns DR等對來自于14個家系的先證者檢查后,發(fā)現(xiàn)了位于ND6基因的14484突變位點[2-3]。G11778A、G3460A、T14484C作為LHON的原發(fā)突變位點已被眾多學(xué)者們熟知,位于編碼呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的基因序列,與臨床中95%的LHON病例密切相關(guān)。在中國的LHON患者中,又以11778突變位點為主(90.9%),相比之下,3460及14484突變位點在我國的LHON患病人群中,所占的比例較低。之所以認(rèn)為上述3個突變位點并非人群中的多態(tài)性,而是原發(fā)性突變位點(primary mutation),是因為這些位點單獨存在即可導(dǎo)致患者出現(xiàn)LHON的臨床癥狀。這些位點參與編碼的呼吸鏈氨基酸,在種屬進(jìn)化過程中高度保守,并且正常人群中并不存在這些突變。目前已經(jīng)證實,上述3種原發(fā)性突變位點以外的多種線粒體DNA的單堿基點突變與LHON發(fā)病相關(guān),這些突變位點被稱之為線粒體繼發(fā)性突變位點,已發(fā)現(xiàn)了30多個,中國人中包括3394、9438、4216等；但3種線粒體DNA原發(fā)性突變位點(G3460A、G11778A、T14484C)是導(dǎo)致失明的危險因素。然而,在該病發(fā)生的性別偏倚、不完全外顯性、病理機(jī)制等方面,仍存在很多疑問。例如,張清炯等的研究發(fā)現(xiàn),中國人攜帶11778位點的家系成員中并非全部受累,僅有52.3%的男性和13.8%的女性出現(xiàn)臨床表現(xiàn)。但是繼發(fā)性突變位點,核基因背景以及單倍體型差別等理論均無法完全解釋LHON的病因、臨床表現(xiàn)以及不同家系中成員的發(fā)病特征差異。 因病因和確切的發(fā)病機(jī)制未完全闡明,迄今為止對于LHON尚無有效的防治措施。大量視功能嚴(yán)重喪失的患者亟待救治,更有大量的遺傳高危人群企盼著有效的預(yù)防措施。通過對LHON的家系研究發(fā)現(xiàn),相當(dāng)多攜帶原發(fā)性突變位點的家系存在不完全外顯性,并且相同突變位點的不同家系其外顯率存在差異,而且家系間患者臨床表現(xiàn)也存在相當(dāng)大的差異。因此提示繼基因突變之后,環(huán)境因素、基因修飾等因素在臨床表現(xiàn)中被發(fā)現(xiàn)起著重要的作用,且僅存在線粒體DNA突變可能并不足以導(dǎo)致突變位點攜帶者發(fā)病,亦即可能存在一個觸發(fā)因素即“二次打擊”環(huán)節(jié)。如果該環(huán)節(jié)發(fā)生在家系成員出生以后,我們就有可能找到預(yù)防發(fā)病的措施；如果該環(huán)節(jié)發(fā)生在出生以前,我們也有可能找到治療該疾病的有效手段。研究發(fā)現(xiàn),LHON患者的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡過程可能與Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。在Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,Caspase-8是啟動凋亡的因子,并參與到Fas介導(dǎo)或非Fas介導(dǎo)的凋亡過程中。因此我們推測,“二次打擊”的環(huán)節(jié)可能與Caspase-8基因的表達(dá)相關(guān),而在其轉(zhuǎn)錄、翻譯至表達(dá)的過程中,Caspase-8基因的甲基化狀態(tài)占有十分重要的地位。 最新的研究結(jié)果提示：在含最常見及最嚴(yán)重的LHON突變型G3460A、 G11778A cybrid(胞質(zhì)雜種)細(xì)胞對Fas誘導(dǎo)凋亡的敏感性明顯增高,cybrid細(xì)胞線粒體生成的reactive oxygen species (ROS)明顯增多,而ROS直接參與了凋亡的發(fā)生。目前凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中了解得最為深入的是經(jīng)典的Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。根據(jù)sFasL可以刺激細(xì)胞表面Fas受體啟動細(xì)胞凋亡途徑這一特性,本實驗使用sFasL作為凋亡誘導(dǎo)物,與已進(jìn)入細(xì)胞周期的外周血單個核細(xì)胞共培養(yǎng),從而了解家系中患者、單純攜帶者、正常成員及家系外對照組研究對象在相同凋亡誘導(dǎo)條件下其凋亡率有無差別,尤其是在家系患者與單純攜帶突變位點但未發(fā)病者之間的差異性,從而為研究相同線粒體基因背景卻發(fā)病狀態(tài)不同這一問題,提供可能的依據(jù)。z-VAD-fmk作為一種不可逆的caspase8抑制劑,可以在蛋白水平抑制caspase8的酶活性。本研究根據(jù)其這一特性,結(jié)合前期實驗結(jié)果將z-VAD-fmk預(yù)處理LHON患者外周血單個核細(xì)胞,并使用sFasL對細(xì)胞群誘導(dǎo)凋亡,分析細(xì)胞在z-VAD-fmk處理組與未處理組其凋亡率的差異,探討caspase8抑制劑z-VAD-fmk在細(xì)胞凋亡過程中起到的可能作用,處理前后兩個階段凋亡率的差異性,尋找抑制細(xì)胞凋亡的有效手段,從而為探討LHON遺傳高危人群有效地防治手段提供思路。 研究目的： 1.對于來自中國江西的一個LHON大家系進(jìn)行眼科檢查及分子生物遺傳學(xué)檢測,了解該家系病患者線粒體DNA點突變的形式及遺傳學(xué)特點,證實本研究提出的“二次打擊學(xué)說”中的“第一次打擊”的存在,也即針對3個原發(fā)性突變位點進(jìn)行分析,探討該家系中是否攜帶目前已知的線粒體DNA原發(fā)性突變位點。 2.檢測LHON點突變攜帶但未發(fā)病家系成員、LHON患者、家系中未攜帶突變位點的成員和正常對照組(家系外未患此疾病人群)Caspase-8基因甲基化或去甲基化狀態(tài)、Caspase-8蛋白質(zhì)的表達(dá),探討Caspase-8基因去甲基化狀態(tài)在這四組研究對象中有無差異,是否可能成為LHON發(fā)病的一個因素。 3.結(jié)合前期的研究成果,探討四組研究對象其外周血淋巴細(xì)胞對sFasL誘導(dǎo)凋亡的反應(yīng)性差異,并探討z-VAD-fmk在抑制患者外周血單個核細(xì)胞凋亡率方面的作用。 研究方法： 1.眼科檢查：先建立臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),然后分別進(jìn)行視力、眼壓、裂隙燈生物顯微鏡、改良的定量Amlser方格、FM100-Hue色覺檢查法、Humphrey750型視野計等視功能的對比研究,然后對研究對象擴(kuò)瞳后用全視網(wǎng)膜鏡、多功能眼底圖象處理系統(tǒng)及OCT3檢測脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的改變。 2.遵循知情同意原則,對家族內(nèi)成員及家系外未患此疾病正常人群抽取其外周靜脈血,分離淋巴細(xì)胞,分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC,包括單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞),制備DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物純化測序,鑒定線粒體DNA G3460A、 G11778A、T14484C等位點的突變。 3.根據(jù)前期實驗結(jié)果,將下一步研究對象分為：家系人員LHON患病成員、突變基因攜帶但未發(fā)病成員和家系內(nèi)未攜帶突變位點的正常成員及家系外正常人,根據(jù)入選標(biāo)準(zhǔn)對以上四組人群再次進(jìn)行外周血采集,分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC),提取細(xì)胞總蛋白,使用western-blot方法檢測Caspase-8蛋白表達(dá)含量,比較四組人群的Caspase-8蛋白表達(dá)是否存在差異性。 4.循前述實驗步驟,提取四組人群的外周血單個核細(xì)胞,提取各組人群的基因組DNA,亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA,進(jìn)行Caspase-8基因甲基化PCR檢測,根據(jù)結(jié)果分析四組人群中的Caspase-8基因甲基化程度差異。 5.在sFasL凋亡誘導(dǎo)處理各組研究對象后,分別測定四組研究對象的外周血單個核細(xì)胞的凋亡率,并比較組間差異。 6.對Leber遺傳性視神經(jīng)病變患病成員的外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行z-VAD-fmk預(yù)處理,并檢測分析預(yù)處理組與未處理組在sFasL凋亡誘導(dǎo)處理后的細(xì)胞凋亡率,并比較組間差異。 研究結(jié)果： 1.家系中存在24名基因突變位點攜帶者,其中有11名患者,他們發(fā)病后的視力介于光感至0.01之間,其中10名患者的視力損害級別為極重度。LHON患者的平均發(fā)病年齡為24.36歲,其中最大發(fā)病年齡為50歲,最小發(fā)病年齡為8歲。而攜帶有突變位點但至今未發(fā)病的人群,平均年齡為40.38歲,其中最大年齡為72歲,最小年齡為5歲。LHON患者的發(fā)病年齡與突變位點攜帶者的年齡相比有統(tǒng)計學(xué)差異(t=2.102,P=0.049)。家系患者共同特點是以嚴(yán)重的視力損害為主,未發(fā)現(xiàn)合并其他眼科疾病以及耳聾、共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)系統(tǒng)合并癥。僅一例雙眼視力下降的時間間隔為一周,其余患者均為雙眼同時漸進(jìn)性視力下降,不伴眼痛等其他不適。本研究家系中所有患者的視力均低于0.01,且迄今為止未見任何視功能恢復(fù)情況。對患者進(jìn)行雙眼眼底熒光素血管造影檢查,結(jié)果顯示：雙眼視盤盤面毛細(xì)血管始終未見熒光充盈,晚期僅見盤沿?zé)晒庵?無熒光遮蔽、視網(wǎng)膜血管無滲漏,并未表現(xiàn)出病程早期典型的視神經(jīng)乳頭周圍的淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張,視網(wǎng)膜血管迂曲擴(kuò)張等癥狀,可能是因為病程較長視神經(jīng)已萎縮所致。 2.經(jīng)采集樣本的72名母系家族成員中,有24名同時攜帶有G11778A和T14502C兩個突變位點,其中的11名為LHON患者,11名LHON患者中男性10名,女性1名,男：女=10：1,其他13名攜帶者至今并未發(fā)病,其余家系成員以及對照組研究對象均未攜帶上述突變位點。所有研究對象中均未發(fā)現(xiàn)G3460A和T14484C兩個突變位點。 3.對家系中LHON患病成員、攜帶突變基因但未發(fā)病成員和家系內(nèi)未攜帶突變位點的正常成員及家系外正常人四組人群外周血單個核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行Caspase-8蛋白western-blot方法檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),四組組間存在差異(F=16.124,P=0.000),LSD法兩兩比較結(jié)果：LHON患病成員組caspase8表達(dá)水平較高,LHON患病成員caspase8蛋白條帶與相應(yīng)GAPDH條帶灰度比值較其他三組升高顯著(P=0.000),突變基因攜帶但未發(fā)病成員、家系內(nèi)未攜帶突變位點的正常成員及家系外正常人三組人群caspase8蛋白條帶與相應(yīng)GAPDH條帶灰度比值差異兩兩比較其差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為0.514、0.506、0.988)。 4.對四組人群進(jìn)行Caspase-8基因甲基化程度研究,結(jié)果顯示：組間存在差異(X2=20.466,P=0.000),對資料進(jìn)行兩兩比較,將檢驗水準(zhǔn)調(diào)整為a=0.007,患病成員組Caspase-8基因非甲基化狀態(tài)陽性率高于其余三組,組間差異顯著,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為0.001、0.000、0.000)。 5. sFasL對單個核細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用的研究： 采用Annexin V-FITC和PI雙染下流式細(xì)胞術(shù),對經(jīng)過sFasL誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行凋亡水平定量檢測,結(jié)果顯示：采用sFasL誘導(dǎo)后,每個組單個核細(xì)胞的凋亡率與自身陰性對照樣本相比均有增加(t=18.877,P=0.000)。四組研究對象細(xì)胞經(jīng)sFasl誘導(dǎo)后凋亡率存在差異(F=3.024,P=0.036),LSD法兩兩比較結(jié)果：與突變基因攜帶但未發(fā)病成員、家系內(nèi)未攜帶突變位點的正常人及家系外正常人這三組研究對象相比,家系內(nèi)Leber遺傳性視神經(jīng)病變患病成員的單個核細(xì)胞經(jīng)sFasl誘導(dǎo)后凋亡率升高顯著(P分別為0.010、0.017、0.110)。但除去LHON患者的剩余三組研究對象,其在細(xì)胞凋亡率方面的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 6.通過z-VAD-fmk預(yù)處理后,對Leber遺傳性視神經(jīng)病變患者的外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行sFasL凋亡誘導(dǎo)后的凋亡率進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在sFasL的誘導(dǎo)下,與患者研究對象組的細(xì)胞凋亡率相比,在適當(dāng)劑量的z-VAD-fmk干預(yù)下,患者研究對象組的同樣細(xì)胞樣本,其細(xì)胞的凋亡率降低,前后差異顯著,其干預(yù)組與非干預(yù)組的凋亡率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.904,P=0.003) 研究結(jié)論： 1.該家系患病成員共同特點是以嚴(yán)重的視力損害為主,家系中攜帶者的突變位點為G11778A及T14502C,且迄今為止所有患者均未出現(xiàn)視力恢復(fù)情況,這一情況與國外對攜帶G11778A位點家系的報道相一致,即患者視力損害嚴(yán)重,恢復(fù)或好轉(zhuǎn)者罕見,預(yù)后差。但在國內(nèi)研究報告中,G11778A突變患者,其中52.1%發(fā)病視力介于0.01與0.1之間,30.3%視力高于0.1,最終恢復(fù)率可達(dá)6.8%。與以上研究相比,本研究家系在臨床表現(xiàn)及疾病預(yù)后方面,較單純攜帶11778位點的家系差,因此G11778A可能與T14502C位點存在一定的協(xié)同作用。 2.本研究結(jié)果顯示本家系LHON的平均發(fā)病年齡為24.36歲,除兩例患者發(fā)病年齡大于35歲,其余患者發(fā)病年齡與國外報告的15-35歲一致,家系患者性別比例男：女=10：1,存在嚴(yán)重的性別偏倚。不完全外顯性是LHON疾病的重要特征,本家系的外顯率為45.8%,即許多攜帶有基因突變位點的家系成員即使明顯大于平均發(fā)病年齡但迄今并未發(fā)病。說明僅僅存在線粒體DNA原發(fā)性突變位點并不足以導(dǎo)致攜帶者發(fā)病,作為必要條件的“第一次打擊”尚不充分,可能需要“二次打擊”環(huán)節(jié)。同時“二次打擊”與“第一次打擊”互相之間應(yīng)該具有足夠強大的協(xié)同效應(yīng)。 3.作為參與Fas介導(dǎo)及非Fas介導(dǎo)凋亡途徑的Caspase-8,其在家系患者中外周血單個核細(xì)胞中蛋白表達(dá)明顯高于單純攜帶未患病者以及正常人群。有研究實驗表明,與正常細(xì)胞相比,原有LHON病理性突變的細(xì)胞對Fas介導(dǎo)的凋亡更加敏感。這表明本家系中患者體細(xì)胞內(nèi)的Caspase-8蛋白表達(dá)異常升高,可能與攜帶線粒體DNA突變位點的細(xì)胞,在病理條件下更容易發(fā)生細(xì)胞凋亡相關(guān)。 4.家系中LHON患病成員,Caspase-8基因非甲基化陽性率明顯高于攜帶突變基因但未發(fā)病成員、家系內(nèi)未攜帶突變位點的正常成員及家系外正常人三組研究對象。這表明由于Caspase-8基因甲基化狀態(tài)很大程度上影響了基因的轉(zhuǎn)錄效率,從而Caspase-8基因甲基化狀態(tài)可能成為導(dǎo)致攜帶LHON突變位點家系成員發(fā)病的一個重要因素。 5.家系中LHON患病成員的外周血單個核細(xì)胞,對sFasL凋亡誘導(dǎo)處理的敏感性明顯高于攜帶突變基因但未發(fā)病成員、家系內(nèi)未攜帶突變位點的正常成員及家系外正常人三組研究對象。結(jié)合“結(jié)論3”可以發(fā)現(xiàn),同一家系在攜帶相同線粒體DNA突變位點的基礎(chǔ)上,與單純攜帶者相比,LHON患者組單個核細(xì)胞不僅在Caspase-8基因非甲基化陽性率上明顯升高,而且在同樣凋亡誘導(dǎo)的處理條件下,LHON患者組細(xì)胞凋亡率更高,因此可以推測Caspase-8基因甲基化狀態(tài)可能是通過提高細(xì)胞對凋亡敏感性而使突變位點攜帶者發(fā)病。 6.通過z-VAD-fmk預(yù)處理,對sFasL誘導(dǎo)的LHON患者的外周血單個核細(xì)胞凋亡過程有保護(hù)作用,且作用顯著,能夠明顯降低細(xì)胞在面對凋亡誘導(dǎo)處理時的凋亡率。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R774.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1561303