本文選題：鼻咽癌　切入點：單核苷酸多態(tài)性　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分 單堿基切除修復(fù)通路中關(guān)鍵基因功能性SNP位點篩選及其與鼻咽癌的關(guān)聯(lián)分析一.研究背景和目的：鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是中國南方尤其是廣東、廣西地區(qū)常見的頭頸部惡性腫瘤。目前有研究認(rèn)為內(nèi)外源性化合物產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygenic species, ROS)導(dǎo)致的DNA損傷參與了NPC的發(fā)生、發(fā)展機制。因此氧化損傷修復(fù)對于維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定,防止細(xì)胞癌變至關(guān)重要。DNA損傷修復(fù)的通路有多條,其中堿基切除修復(fù)(base excision repairBER)是主要途徑。BER相關(guān)基因及其編碼的蛋白功能下降將會使DNA損傷的修復(fù)功能受損,從而增加細(xì)胞癌變的風(fēng)險。已有研究表明,單堿基修復(fù)的BER途徑中多個關(guān)鍵基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)能夠影響DNA的修復(fù)功能。對于該通路相關(guān)基因SNP與NPC易感性的相關(guān)研究目前報道不多,且部分研究的結(jié)果并不一致。因此本研究利用生物信息學(xué)的方法和以往文獻(xiàn)篩選BER相關(guān)基因中具有潛在功能的SNP,并通過病例對照分析的方法,納入來源于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院的NPC患者及健康對照,通過對比二者之間分布頻率進(jìn)行驗證,以找到該通路相關(guān)基因中NPC風(fēng)險相關(guān)性SNP。二.材料與方法：(一).利用生物信息學(xué)技術(shù)對BER中關(guān)鍵基因進(jìn)行篩選。1.BER通路中候選基因的確定：根據(jù)以往的文獻(xiàn)確定BER通路中關(guān)鍵基因作為后續(xù)SNP檢測的候選基因。2.候選基因SNP的數(shù)據(jù)下載：從International Hap Map Project數(shù)據(jù)庫下載。 3.標(biāo)簽SNP(tag SNP)勺確定：采用Haploview4.2軟件對已下載的各候選基因SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,確定每個候選基因中符合標(biāo)準(zhǔn)的tagSNP。4.在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中將每個候選基因包括的全部SNP位點,在EXON及5'UTR.3'UTR區(qū)中的SNP位點進(jìn)行核實,將未曾在TagSNP出現(xiàn)的這三個區(qū)域位點進(jìn)行替換。5.在http://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snpfunc.htm網(wǎng)站中將上述篩選得到的tagSNP位點進(jìn)行潛在功能性預(yù)測。6.綜合考慮SNP位點所在的功能區(qū)、功能預(yù)測結(jié)果、PHWE、MAF以及已發(fā)表的文獻(xiàn)研究結(jié)果,篩選出符合條件的候選SNP作后續(xù)研究。(二).BER通路相關(guān)基因候選SNP位點的初步篩選：共納入研究對象共459例,其中鼻咽癌患者204例,對照組患者255例。抽取外周靜脈血,提取DNA。采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization-time of fly mass spectrum,MALDI-TOF-MS)對樣本進(jìn)行BER通路相關(guān)基因候選SNP分型測定。(三).BER通路中入選基因SNP位點的驗證：1.在初步篩選的基礎(chǔ)上進(jìn)一步擴大NPC患者及健康無癌對照的例數(shù),總共納入488例NPC患者和與573例未患癌的正常人進(jìn)行研究。2.抽取新加入NPC患者或正常健康對照3m1外周血,進(jìn)行DNA提取。3.采用TaqMan探針實時熒光PCR法進(jìn)行hOGG1 rs1052133和hMUTYHrs3219472 SNP基因型分型。三.結(jié)果：(一).通過本研究篩選標(biāo)準(zhǔn)和策略,共選擇出BER通路中19個關(guān)鍵基因,共38個tagSNP進(jìn)行后續(xù)的驗證。(二).共納入204例NPC患者及255例健康對照進(jìn)行SNP初步篩選。MALDI-TOF-MS共檢測出34個具有潛在功能的SNP,其野生型等位基因頻率與突變型等位基因頻率差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均大于0.05)。我們挑選P值最小的2個SNP,即hOGGl rs1052133 (P=0.054)、hMUTYH rs3219472(P=0.075)作為后續(xù)的驗證。(三)hOGG1 rs 1052133和hMUTYH rs3219472 SNP與NPC易感性關(guān)系的進(jìn)一步驗證：1.共納入488例NPC患者和573例正常對照者進(jìn)行hOGG1 rs1052133和MUTY rs3219472 SNP分型。2.hOGGl rs1052133 SNP與NPC發(fā)病風(fēng)險相關(guān)性：利用recessive model檢測發(fā)現(xiàn),NPC患者組中hOGG1 rs10 52133GG基因型頻率顯著低于健康對照組(30.9%vs 36.8%),相對于GC或CC基因型,GG患NPC的風(fēng)險降低,OR=0.769(95%CI 0.595～0.993)。 OR=0.770 (95%CI 0.595～0.996)。在年齡大于40歲的研究對象中,GG基因型攜帶者發(fā)生NPC的風(fēng)險是GC或CC基因型的0.706倍(OR=0.706,95%C10.524-0.950),校正OR值=0.707(95%C10.524-0.953)。在女性中,GG基因型發(fā)生NPC的風(fēng)險是CC或GC者的0.571倍(OR=0.571,95%CI0.337-0.968),校正OR=0.574(95%C10.338-0.975)。在非吸煙者中,攜帶GG基因型者患NPC的風(fēng)險是CC或GC者的0.635倍(OR=0.635,95%CI0.464-0.866),校正OR=0.634(95% CI 0.463～0.868)。hMUTYH rs3219472 SNP,即AA型或GA+GG基因型頻率在NPC患者組和健康對照組中均無顯著差別。3.hOGG1 rs 1052133和 hMUTYH rs3219472 SNP對NPC患病風(fēng)險的聯(lián)合作用：同時攜帶hOGGl rs 1052133 CC基因型和hMUTYH rs3219472 AA基因型者(CC/AA)患NPC的風(fēng)險顯著高于GG/GG、GG/GA、 GG/AA,OR值分別為2.887、3.183、3.392。四.結(jié)論：1.BER通路相關(guān)基因中,hOGGl rs 1052133 SNP可能與NPC風(fēng)險密切相關(guān)。其中GG基因型可能是降低NPC發(fā)病風(fēng)險的保護性因子,特別是對于女性、年齡大于40歲、非吸煙人群。2.hOGG1 rs1052133 SNP可與 hMUTYH rs 3219472 SNP相互作用而影響NPC的易感性。第二部分hOGGl rs 1052133多態(tài)性與NPC臨床相關(guān)研究一.研究背景和目的：NPC是中國南方常見的惡性腫瘤,每年的發(fā)病率為20-30/100,000。目前NPC的發(fā)生、發(fā)展的機制仍不十分清楚。本研究第一部分結(jié)果顯示,攜帶hOGG1rs1052133 GG基因型SNP者患NPC的風(fēng)險可能較其他基因型低,提示該SNP可能與NPC的發(fā)生密切相關(guān)。但其具體機制如何,目前鮮有相關(guān)報道。有研究表明,rs1052133C C型SNP與某些惡性腫瘤臨床特性和預(yù)后有關(guān)。作為中國南方地區(qū)主要的頭頸部惡性腫瘤,NPC的臨床特征及預(yù)后與該SNP是否有關(guān)值得研究。因此,本研究收集NPC患者的臨床樣本(包括腫瘤組織、血清)及臨床資料進(jìn)行分析,評估NPC患者體內(nèi)hOGG1基因、其編碼蛋白的功能狀態(tài)、rs1052133 SNP與患者臨床參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性,以期進(jìn)一步闡明該SNP在NPC發(fā)生發(fā)展中的機制。二.方法1.研究對象：(1)為進(jìn)行免疫熒光染色檢測,我們收集了2013年1月至2014年6月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及附屬腫瘤醫(yī)院就診,由病理確診為NPC的初診患者40例,經(jīng)活檢病理證實鼻咽部粘膜慢性炎而排除NPC的健康人15例。研究對象在進(jìn)行鼻咽部組織活檢時,留取部分組織樣本用于免疫熒光染色；(2)納入在廣西醫(yī)科大學(xué)一附院和附屬腫瘤醫(yī)院初診的99例NPC患者,抽取其外周靜脈血并制備血清,用ELISA法檢測血清中8-OHdG含量。(3)hOGG1rs1052133 SNP與NPC預(yù)后相關(guān)性研究：在本研究第一部分接受了hOGGl rs1052133SNP分型的488例NPC患者均作為預(yù)后分析的候選對象。收集并分析這些患者的臨床資料,按入選標(biāo)準(zhǔn)篩選出符合條件患者進(jìn)行預(yù)后分析。2.操作步驟：(1)免疫熒光染色結(jié)果均由兩位實驗者獨立觀察判斷,取平均值進(jìn)行匯總。鏡下直接計數(shù)并同時采用激光共聚焦圖象數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行熒光強度計算,客觀算出各樣品光強度；(2)ELISA檢測：用ELISA試劑盒進(jìn)行99例患者血清8-OHdG濃度。(3)hOGG1 rs 1052133 SNP 與NPC預(yù)后關(guān)聯(lián)性研究：按納入標(biāo)準(zhǔn)入選的371例NPC患者均接受了根治性放療,部分Ⅱb、Ⅲ、Ⅳ期病人還接受了誘導(dǎo)化療或同期化療或輔助化療。所有患者均接受了隨訪。應(yīng)用單因素和多因素分析方法研究這371例NPC患者h(yuǎn)OGG1 rs1052133 SNP與他們的總生存率(overall survival,OS)和無瘤生存率(tumor-free survival, TFS)的相關(guān)性。(4).統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。三.結(jié)果1.NPC癌組織中hOGG1和8-OHdG表達(dá)與hOGG1rs 1052133 SNP目關(guān)性：(1)40例NPC患者的癌組織和15例粘膜慢性炎患者的炎癥組織進(jìn)行免疫熒光染色檢測：NPC組織中8-OHdG表達(dá)強度顯著高于慢性粘膜炎組織(P=0.003)。GG+GC型(P=0.004)、GC型(P=0.008)的NPC組織中8-OHdG表達(dá)強度明顯高于慢性炎組織,GG型NPC組織中8-OHdG表達(dá)強度存在高于粘膜慢性炎組織的趨勢(P=0.062)。 (2)ELISA檢測結(jié)果：99例NPC患者中,GG型患者血清中8-OHdG含量要顯著低于GC或CC者(P=0.038)。(3)hOGG1rs 1052133 SNP與NPC預(yù)后相關(guān)性：第一部分的488例NPC患者中共371例滿足入選標(biāo)準(zhǔn)而納入后續(xù)的生存分析。所有病人均接受了隨訪。中位隨訪時間為6-48月,隨訪過程中23例(6.2%)出現(xiàn)病情進(jìn)展。隨訪結(jié)束時,共12例(3.2%)患者死于NPC進(jìn)展。371例NPC患者h(yuǎn)OGG1rs 1052133 SNP分型與OS的關(guān)系：僅有T分期(p=0.026)與OS顯著相關(guān),而CC基因型((P=0.139)與OS無顯著相關(guān)性。371例NPC患者TFS的單因素分析結(jié)果顯示：T分期(p＝0.018)、CC基因型(p=0.043)與TFS顯著相關(guān)。多因素分析結(jié)果顯示,T分期(HR 5.123,95%CI 1.199-21.886)、CC基因型(HR 2.539,95%CI 1.068-6.033)是影響NPC的TFS獨立危險因子。3.我們還納入339例晚期鼻咽癌患者(Ⅲ+Ⅳ期)進(jìn)行hOGG1 rs1052133多態(tài)性與OS和TFS相關(guān)性分析。OS的單因素分析結(jié)果顯示CC基因型(P=0.117)與OS無顯著相關(guān)性。TFS的單因素分析結(jié)果顯示,T分期(p=0.028)、CC基因型(p=0.076)與TFS存在相關(guān)趨勢,而多因素分析結(jié)果顯示,T分期(HR 7.235,95%CI 0.972-53.864)(p=0.053),CC基因型(HR2.368,95%CI 1.199-21.886) (p=0.061)存在獨立影響TFS的趨勢。四.結(jié)論1.鼻咽癌組織中8-OHdG表達(dá)率顯著高于慢性粘膜炎組織,提示8-OHdG可能與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。2.攜帶GG基因型hOGG1的鼻咽癌患者血清8-OHdG濃度顯著低于攜帶CC或GC的患者,提示GG基因型的hOGG1切除修復(fù)DNA損傷的功能可能較CC或GC基因型低下。3.hOGG1 rs 1052133 CC SNP可能是預(yù)測NPC治療后進(jìn)展的獨立危險因素。第三部分hOGGl rs1052133 SNP與鼻咽癌相關(guān)的體外功能研究一.研究背景和目的：本研究第一部分的結(jié)果表明,攜帶hOGG1 rs1052133GG型者患NPC的風(fēng)險較CC和GC型顯著下降,提示該基因型是NPC的保護性因子,與一些報道并不一致。原因可能有：(1)以往的研究的病例數(shù)較少。(2)對于來自不同種族、地理環(huán)境的人群,其h OGG1 rs 1052133的不同基因型在NPC發(fā)病機制中的作用可能不同。有學(xué)者認(rèn)為,攜帶GG基因型細(xì)胞中hOGG1修復(fù)功能下降,導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷積累過多,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,防止細(xì)胞惡變。還有學(xué)者認(rèn)為,GG基因型的hOGG1功能只有在有過度氧化應(yīng)激壓力的環(huán)境中才低于CC基因型。研究認(rèn)為,健康人體內(nèi)也可能存在腫瘤細(xì)胞,由于機體免疫系統(tǒng)的抑制而未發(fā)展和產(chǎn)生臨床癥狀,與人體長期共存。免疫系統(tǒng)主要是通過細(xì)胞免疫來抑制殺傷腫瘤細(xì)胞。而免疫細(xì)胞也可通過產(chǎn)生ROS等活性氧物質(zhì)使腫瘤細(xì)胞發(fā)生氧化損傷,從而導(dǎo)致其凋亡。我們第二部分的研究結(jié)果表明,CC型是預(yù)測NPC患者復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的獨立危險因子。研究表明,放療和化療藥物也可通過誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS來促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)合本研究第一、二部分的研究結(jié)果及文獻(xiàn)報道,我們提出以下假說,hO GG1rs 1052133SNP可能參與了NPC的發(fā)生、發(fā)展以及治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移：1.人體鼻咽部可能存在無臨床表現(xiàn)的隱匿癌,由于體內(nèi)免疫細(xì)胞可產(chǎn)生ROS導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡而未能進(jìn)一步發(fā)展。如果受損傷的腫瘤細(xì)胞具備自我修復(fù)能力,就有增殖發(fā)展的機會。研究表明,攜帶CC型細(xì)胞自我修復(fù)的能力明顯高于GG型者。因此,可以推測攜帶CC型SNP的腫瘤細(xì)胞自我修復(fù)的能力也應(yīng)高于GG型細(xì)胞,因此前者發(fā)展成臨床癌的風(fēng)險可能要高于后者。腫瘤細(xì)胞自我修復(fù)能力越強,其增殖發(fā)展成具有臨床表現(xiàn)的臨床癌的機會就越大。2.NPC細(xì)胞在遭受根治性放療及化療的損傷后,是否復(fù)發(fā)和復(fù)發(fā)時間的長短,可能取決于腫瘤細(xì)胞損傷后修復(fù)的能力。治療后修復(fù)能力越強,則復(fù)發(fā)機會越大及復(fù)發(fā)時間越短。CC基因型的hOGG1較強的修復(fù)能力可能是攜帶該SNPNPC患者的復(fù)發(fā)時間較短的原因之一。因此,為驗證以上的假說,我們通過構(gòu)建慢病毒hOGG1 rs 1052133 GG和CC型過表達(dá)載體,在體外轉(zhuǎn)染人鼻咽癌細(xì)胞株,從而構(gòu)建穩(wěn)定攜帶h OGG1 rs1052133 GG和hOGG1 rs1052133 CC鼻咽癌細(xì)胞模型。通過觀察其生物學(xué)特性的改變來研究該SNP對NPC發(fā)生和治療后復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)機理。二.材料和方法：1.實時熒光測定不同鼻咽癌細(xì)胞系及永生化正常鼻咽部上皮細(xì)胞系,包括HK1、HONE1、5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、NP69中hOGG1mRNA表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)HK-1細(xì)胞中表達(dá)量最低,故選該細(xì)胞系做后續(xù)細(xì)胞模型構(gòu)建。2. hOGG1基因表達(dá)載體的慢病毒包裝,感染HK1細(xì)胞建立包括空載慢病轉(zhuǎn)染的HK-1 (N-HK-1),轉(zhuǎn)染OGG1-CC基因型的HK-1(OGG1-CC-HK1),轉(zhuǎn)染OGG1-GG基因型HK-1(OGG1-GG-HK1)。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。qPCR測定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的N-HK1,OGG1-CC-HK1,OGG1-GG-HK1細(xì)胞中hOGG1mRNA表達(dá)水平。Western-blot(WB)檢測各組細(xì)胞hOGG1蛋白的表達(dá)。測序鑒定OGG1-CC-HK1,OGG1-GG-HK1細(xì)胞中目標(biāo)基因序列。3.MTT法進(jìn)行HK1、N-HK1、OGG1-CC-HK1、OGG1-GG-HK1細(xì)胞無氧化應(yīng)激壓力下增殖活力檢測。4.光動力療法(Photodynamic Therapy, PDT)干預(yù)后不同細(xì)胞模型修復(fù)能力的檢測：應(yīng)用低劑量5一氨基酮戊酸(5一ALA)作為光敏劑的PDT,對HK1、N-HK1、OGG1-CC-HK1、OGG1-GG-HK1細(xì)胞進(jìn)行照射,MTT檢測照射前后細(xì)胞活力,從而分析各細(xì)胞模型的損傷修復(fù)能力。5.細(xì)胞內(nèi)免疫印跡(in-cell Western,ICW)檢測5-ALA-PDT后8-OHdG/hOGG1的變化。6.ELISA檢測5-ALA-PDT處理后各細(xì)胞模型培養(yǎng)液上清中8-OHdG含量。7.流式細(xì)胞儀檢測各細(xì)胞模型照射前后在細(xì)胞周期各階段的細(xì)胞比率。8.我們還將PDT前后各組細(xì)胞,包括N-HK1、OGG1-CC-HK1、 OGG1-GG-HK1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測定,分析OGG1rs1052133 SNP對各組細(xì)胞基因的表達(dá)的影響。三.結(jié)果1.qPCR測定慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后目的基因表達(dá)情況：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的HK1細(xì)胞中OGG1-GG-HK1和OGG1-CC-HK1mRNA表達(dá)水平約是空載N-HK1的2.3倍。WB檢測發(fā)現(xiàn)OGG1-GG-HK1和OGG1-CC-HK1 hOGG1蛋白表達(dá)量略高于N-HK1細(xì)胞；2.測序結(jié)果：在兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株細(xì)胞OGG1-CC-HK1,OGG1-GG-HK1中提取nRNA,并逆轉(zhuǎn)成cDNA后送測序鑒定。結(jié)果顯示兩個目的序列僅在rs1052133突變位點存在CC/GG變異外,其余序列均不變。3.無應(yīng)激壓力時各細(xì)胞株生長情況：結(jié)果顯示OGG1-GG-HK1細(xì)胞在新接種后的第2、3、4天活力略弱于其他各組(P0.01);4.5-ALA-PDT處理后各細(xì)胞系的修復(fù)能力測定：計算PDT后12h,18h,24h,36hMTT吸光度值與6h吸光度值的比值,檢測各組比值隨時間變化情況。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染了hOGG1基因的兩個實驗組比值較N-HK1和HK1組顯著增高,顯示出前者更快的修復(fù)能力,而OGG1-GG-HK1的修復(fù)能力要略弱于野生型OGG1-CC-HK1細(xì)胞,在PDT后24h表現(xiàn)尤為明顯,24h后在各組間P0.05,有統(tǒng)計學(xué)差異。6. ICW檢測PDT前后各組細(xì)胞內(nèi)8-OHdG與hOGG1比值變化：無損傷應(yīng)激的情況下(PDT前),OGG1-GG-HK1細(xì)胞中單位8-OHd G的含量明顯低于其他各組,而在氧化損傷后18h,24h OGG1-GG-HK1細(xì)胞中單位hOGG1含量下8-OHdG明顯上調(diào),提示在修復(fù)過程中OGG1-GG基因型修復(fù)功能可能略弱于OGG1-CC基因型。7.轉(zhuǎn)錄組測定結(jié)果顯示,OGG1-GG-HK-1在PDT后24h的hOGG1mRNA水平較OGG1-CC-HK-1(約2.6倍),而前者PDT前與PDT后24h該mRNA水平并無差別。OGG1-CC-HK-1在PDT后24h的mRNA水平較PDT前增加約2.23倍,提示OGG1-CC-HK-1可能具備氧化損傷后通過增加hOGG1表達(dá)來提高修復(fù)效率的能力,而OGG1-GG-HK-1并沒有該能力。本研究結(jié)果還顯示OGG1-CC-HK-1中SLC39A10 mRNA PDT前上調(diào),PDT后進(jìn)一步上調(diào)至對照的2.4倍,而OGG1-GG-HK-1 PDT前該基因下調(diào),PDT后無改變。在PDT前,OGG1-GG-HK1的DUSP6,DUSP4和LAPTM5 mRNA均上調(diào),而在OGG1-CC-BK1中下調(diào)；PDT后,前者中這些基因的mRNA表達(dá)仍高于后者。PDT前OGG1-GG-BK1的GADD34 mRNA上調(diào),而PDT后無變化。OGG1-CC-HK1中該基因在PDT前下調(diào),PDT后由原來的下調(diào)逆轉(zhuǎn)為上調(diào)。四.結(jié)論1.成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的OGG1-CC-HK-1和hOGG1-GG-HK-1鼻咽癌細(xì)胞模型。2. OGG1-CC-HK-1在光動力治療后修復(fù)能力高于OGG1-GG-HK-1。這可能與后者在氧化應(yīng)激壓力環(huán)境下hOGGl功能下調(diào)和ml RNA水平下降有關(guān)。3.hOGG1rs1052133SNP可通過改變多個下游基因,包括SLC39A10、 DUSP6、DUSP4、LAPTM5、GADD34的表達(dá)來影響HK1細(xì)胞的凋亡活性。第四部分hO6G1rs1052133多態(tài)性在荷瘤裸鼠體內(nèi)的功能研究一.研究背景和目的：hOGG1rs1052133 SNP對NPC細(xì)胞的影響還需要在動物腫瘤模型中進(jìn)行驗證。動物腫瘤模型對于惡性腫瘤發(fā)生機制的研究具有重要意義,其主要分為以下幾類：(1)自發(fā)腫瘤模型；(2)誘發(fā)腫瘤模型；(3)基因修飾腫瘤模型；(4)移植性腫瘤模型。其中移植性腫瘤模型目前應(yīng)用較為廣泛,主要分為同種移植性腫瘤模型和異種移植性腫瘤模型。移植性腫瘤模型目前應(yīng)用較多的是裸鼠,該模型具有以下優(yōu)點：(1)成瘤率穩(wěn)定,且個體之間腫瘤生長速度較一致,個體差異��；(2)模型建立時間較短、操作方便；(3)移植瘤能夠保持原發(fā)瘤的生物學(xué)特性和病理特性；(4)所用的免疫缺陷動物細(xì)胞免疫功能低下。因此腫瘤,特別是來源于人類的異體腫瘤移植成功率高,幾乎所有的腫瘤均能在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤。在本研究第三部分中,我們應(yīng)用NPC細(xì)胞株進(jìn)行hOGG1 SNP的體外功能研究。但體外實驗結(jié)果意義有限,因為體外單層培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性與活體內(nèi)三維實體腫瘤細(xì)胞群體有明顯的差異,體內(nèi)腫瘤細(xì)胞群體處于細(xì)胞與細(xì)胞以及細(xì)胞與基質(zhì)相互作用的腫瘤微環(huán)境中,這是體外實驗所無法模擬的。因此在本部分的研究中,我們應(yīng)用BALB/c裸鼠建立N-HK1、hOGG1rs1052133 GG-HK-1和hOGG1rs1052133 CC-HK-1移植瘤模型,來探討hOGG1過表達(dá)以及rs1052133 S IP在活體內(nèi)對NPC細(xì)胞系HK-1的影響。我們相信在裸鼠等活體內(nèi)的研究結(jié)果比體外實驗更能夠客觀反映hOGG1及其SNP在NPC發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的機制。二.實驗方法：1.HK1、N-HK1、OGG1-CC-HK1、OGG1-GG-HK1細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、計數(shù)；2.動物分組：用隨機數(shù)字表將動物隨機分成4組,分別為HK1、N-HK1、OGG1-CC-HK1、OGG1-GG-HK1移植組,每組5只。3.細(xì)胞準(zhǔn)備與接種：收集HK1、N-HK1、OGG1-CC-HK1、OGG1-GG-HK1細(xì)胞,配置成細(xì)胞懸液注射入裸鼠右腋皮下,每隔1天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小,接種后1月,斷頸處死小鼠,取腫瘤稱重。4.實時熒光定量PCR檢測移植瘤內(nèi)hOGG1mRNA水平。5.測序鑒定HK1、N-HK1、OGG1-CC-HK1、OGG1-GG-HK1細(xì)胞組內(nèi)hOGG1基因rs1052133 SNP的情況。三.結(jié)果移植瘤成瘤情況：HK1、N-HK1、OGG1-CC-HK1、 OGG1-GG-HK1四組細(xì)胞均在裸鼠體內(nèi)成瘤,成瘤率100%。出瘤時間大約在接種后第5-8天,前三周腫瘤生長較為緩慢,最后一周生長速度明顯加快。4組間瘤體重量兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但未轉(zhuǎn)染hOGGl的HK1和N-HK1的移植瘤合并組與轉(zhuǎn)染hOGGl的OGG1-CC-HK1和OGG1-GG-HK1合并組進(jìn)行比較,前者的平均瘤重明顯小于后者(0.360g±0.16g vs 0.591±0.23)(P=0.021)。四.結(jié)論1.本研究成功構(gòu)建了hOGG1過表達(dá)HK-1移植瘤裸鼠模型(HK--1、N-HK1、 OGG1-GG-HK-1和OGG1-CC-HK-1),為今后進(jìn)一步研究該SNP與NPC發(fā)生、發(fā)展等研究提供平臺。2.hOGGl過表達(dá)能夠促進(jìn)裸鼠移植鼻咽癌HK-1細(xì)胞的增殖。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳曉紅;于祥遠(yuǎn);王程強;;XRCC1Arg399Gln基因多態(tài)性與鼻咽癌易感性的Meta分析[J];重慶醫(yī)學(xué);2015年28期

2 秦緒軍;何偉;海春旭;;Bcl-2蛋白在腫瘤放化療氧化損傷中的作用[J];癌變.畸變.突變;2014年05期

3 郭俊;李小燕;蔡倫;張魁;董然;王綠婭;杜杰;;基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)檢測華法林代謝酶基因多態(tài)性[J];臨床檢驗雜志;2014年06期

4 陳凌娟;賈玉璽;申麗潔;;巢式PCR在弓形蟲檢測和基因研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J];中國病原生物學(xué)雜志;2013年06期

5 陶艷亭;郭魯;孫平;蔣雅麗;黃慶;王曉蕾;張蓮英;;鋅轉(zhuǎn)運體ZIP10過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2012年12期

6 趙四敏;陳旭東;趙國強;董子明;;突變型DNA聚合酶β真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)[J];重慶醫(yī)學(xué);2012年17期

7 芮瑞;劉莉;段生宇;鐘榮;劉麗;聶紹發(fā);繆小平;袁們;;XRCC1基因多態(tài)性與乳腺癌遺傳易感性的Meta分析[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2011年09期

8 紀(jì)龍;莊東明;余紅平;;APE1/Ref-1基因單核苷酸多態(tài)性與肝細(xì)胞肝癌的研究進(jìn)展[J];泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2009年12期

9 吳昊;謝裕安;;XRCC1基因多態(tài)性與腫瘤易感性的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2009年05期

10 陳小波;黃云超;;8-羥基脫氧鳥苷與肺癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J];中國肺癌雜志;2009年01期

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本文編號：1556871