本文關(guān)鍵詞： 角膜內(nèi)皮細胞 LIF STAT3 接觸抑制 增殖 E2F2 p16~(INK4a)　出處：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：本研究旨在探究人角膜內(nèi)皮細胞在改良胚胎干細胞培養(yǎng)基體外培養(yǎng)中能持續(xù)增殖并延遲接觸抑制的相關(guān)機制。 方法：通過比較人角膜內(nèi)皮單層細胞在SHEM, ESCM, ESCM+LIF, ESCM+bFGF和MESCM等不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)第7,21,35和42天后5-溴脫氧尿嘧啶核苷染色情況來判斷人角膜內(nèi)皮細胞在不同環(huán)境下的增殖能力。并通過qRT-PCR檢測和定量分析胚胎干細胞標志物,神經(jīng)嵴細胞標志物,骨形成蛋白配體和受體以及細胞周期相關(guān)基因的表達情況。通過共聚焦熒光染色顯微鏡等技術(shù)觀察相關(guān)信號通路關(guān)鍵蛋白在細胞不同部位的表達情況,從而明確人角膜內(nèi)皮細胞延遲接觸抑制的相關(guān)信號通路機制。 結(jié)果：人角膜內(nèi)皮細胞在SHEM培養(yǎng)基中第21天時5-溴脫氧尿嘧啶核苷染色陰性,而在ESCM+LIF和MESCM中第35天時仍染色陽性。另外,在ESCM中添加白血病抑制因子(LIF, leukemia inhibitory factor)不僅和MESCM一樣可以明顯增加其中7種胚胎干細胞和神經(jīng)嵴細胞標志物的表達,還可以明顯增加Oct4, Rexl和SSEA4等胚胎干細胞標志物的表達。在ESCM中單獨或同時添加LIF和bFGF都不足以激活經(jīng)典或非經(jīng)典的BMP信號通路。進一步分析發(fā)現(xiàn)磷酸化的STAT3核轉(zhuǎn)位只有在包含LIF的培養(yǎng)基中才存在,提示LIF激活了培養(yǎng)的人角膜內(nèi)皮細胞中的LIF-JAK1-STAT3信號通路。第35天時通過JAK1和STAT3siRNA的基因敲減技術(shù)處理可以消除人角膜內(nèi)皮細胞在LIF包含的培養(yǎng)基中陽性的5-溴脫氧尿嘧啶核苷染色和G1/S細胞周期相關(guān)基因p-Rb等的核轉(zhuǎn)位,進一步證實延遲人角膜內(nèi)皮細胞的接觸抑制確實受LIF-JAK1-STAT3信號通路的調(diào)控。 結(jié)論：和SHEM相比,MESCM培養(yǎng)基可以通過延遲人角膜內(nèi)皮細胞接觸抑制的重建促進角膜內(nèi)皮細胞的體外增殖生長。其中LIF而不是bFGF可以激活LIF-JAK1-STAT3信號通路并通過促進G1/s細胞周期正向基因的表達,從而達到延遲人角膜內(nèi)皮細胞接觸抑制的作用。
[Abstract]:Aim: to investigate the mechanism of human corneal endothelial cells proliferation and delayed contact inhibition in vitro. Methods: human corneal endothelial monolayer cells were cultured in different culture medium, such as Shem, ESCM, ESCM LIF, ESCM bFGF and MESCM. The 5-bromodeoxyuridine (5-bromodeoxyuridine) staining of human corneal endothelial cells in different environment was determined by comparing the 5-bromodeoxyuridine (5-bromodeoxyuridine) staining of human corneal endothelial monolayer cells cultured in different media. And to detect and quantify the markers of embryonic stem cells by qRT-PCR, The expression of neural crest cell markers, bone morphogenetic protein ligands and receptors, and cell cycle related genes were observed by confocal fluorescent staining. Therefore, the mechanism of delayed contact inhibition in human corneal endothelial cells was clarified. Results: human corneal endothelial cells were negative in 5-bromodeoxyuridine staining on the 21st day in SHEM medium, but still positive in ESCM LIF and MESCM on the 35th day. The addition of Leukemia Inhibitors (LIF, leukemia inhibitory Factor) to ESCM not only increased the expression of seven markers of embryonic stem cells and neural crest cells, but also increased the expression of LIF, leukemia inhibitory factor and MESCM. The expression of ESC markers such as Oct4, Rexl and SSEA4 were significantly increased. The addition of LIF and bFGF in ESCM alone or at the same time was not sufficient to activate the classical or non-classical BMP signaling pathway. Further analysis revealed that phosphorylated STAT3 nuclear transduction was not sufficient. The site only exists in the medium containing LIF, The results suggest that LIF activates the LIF-JAK1-STAT3 signaling pathway in cultured human corneal endothelial cells. At day 35, the positive 5-bromodeoxyuridine of human corneal endothelial cells in LIF medium can be eliminated by JAK1 and STAT3siRNA gene knockout technique. Nucleoside staining of pyrimidine and nuclear translocation of p-Rb and other genes associated with cell cycle of G1 / S cells. It is further confirmed that the delayed contact inhibition of human corneal endothelial cells is indeed regulated by the LIF-JAK1-STAT3 signaling pathway. Conclusion: compared with SHEM, MESCM can promote the proliferation and growth of corneal endothelial cells by delaying the reconstitution of human corneal endothelial cell contact inhibition in vitro. LIF, not bFGF, can activate the LIF-JAK1-STAT3 signaling pathway and promote G1 / s. Cell cycle forward gene expression, In order to delay the contact inhibition of human corneal endothelial cells.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R772.2

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本文編號：1503713