發(fā)布時間：2018-02-07 12:39

  本文關(guān)鍵詞： Egr-1 5-FU hTERTC27 鼻咽癌 TCF3 胚胎癌 Oct4　出處：《吉林大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：1Egr-hTERTC27聯(lián)合5-FU治療鼻咽癌的實驗研究 研究背景 鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma，NPC）是一種發(fā)生于鼻咽部粘膜的惡性腫瘤。多發(fā)區(qū)主要在中國的廣東、廣西、福建等地。發(fā)病年齡范圍較廣，主要為中年人，也有青少年患病者。鼻咽癌惡性程度很高，常常伴有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。發(fā)病因素較為復(fù)雜，包括遺傳因素、EB病毒因素和環(huán)境致癌因素。目前鼻咽癌的治療主要以局部放射治療和化學(xué)療法為主。但是，對于晚期鼻咽癌和早期切除但預(yù)后不良的鼻咽癌患者，目前仍然沒有有效的治療方式。因此，尋找一種新的治療方式迫在眉睫。 5-氟尿嘧啶（5-Fluroracil，5-FU）是一種常用的治療鼻咽癌的化療藥物，它是尿嘧啶5位上的氫被氟取代的一種衍生物，能夠抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，干擾DNA和蛋白質(zhì)的合成。然而，5-FU毒性作用較大，患者常常因為耐受不了高劑量5-FU引起的不良反應(yīng)而被迫終止治療。因此，尋求新型的生物治療方式來聯(lián)合殺傷腫瘤細(xì)胞，協(xié)同減低化療藥物的使用劑量，提高患者的耐受能力，增強(qiáng)腫瘤化療的治療效果是目前急需解決的問題之一。 早期生長反應(yīng)基因1(early growth response gene，Egr-1)啟動子中有6個CArG[CC(A+T-rich)6GG]血清反應(yīng)元件，在電離輻射或化學(xué)藥物的誘導(dǎo)下可以被激活，從而啟動下游基因的表達(dá)，這種作用是通過ROIs（reactive oxygen intermediates，ROIS）介導(dǎo)的�？茖W(xué)家利用Egr-1啟動子作為橋梁，提出了腫瘤的基因-化學(xué)治療設(shè)想。將同時具有誘導(dǎo)特性的Egr-1啟動子和腫瘤殺傷基因或是免疫治療基因轉(zhuǎn)入體內(nèi)，在對腫瘤進(jìn)行化療的同時誘導(dǎo)目的基因的高表達(dá)，從而達(dá)到化學(xué)治療和基因治療的雙重腫瘤殺傷作用，降低等效化療藥物的治療劑量，緩解正常組織的損傷，降低毒副作用，提高治療效果。利用Egr-1啟動子的橋梁作用，聯(lián)合治療基因如CD、TK、CDglyTK、endostatin等治療胃腸道癌、腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌等惡性腫瘤已取得了令人矚目的成績。 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶的一個催化亞單位，對于保持端粒長度和延長細(xì)胞壽命具有重要作用。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常細(xì)胞中幾乎很少表達(dá)。因此，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶可作為比較理想的腫瘤檢測診斷的標(biāo)志和腫瘤基因治療的靶點。hTERTC27，是人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶C-末端一個27kDa的多肽，該片段保留了端粒酶RNA結(jié)合域而去除了逆轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域，2002年香港大學(xué)Huang JJ與Lin MC教授利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了hTERTC27多肽片段。體外實驗研究證實在人宮頸癌HeLa細(xì)胞中過表達(dá)hTERTC27可以引起端粒的功能異常，促使染色體末端快速融合，并且增強(qiáng)細(xì)胞對過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，hTERTC27過表達(dá)可以誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和老化，對于接種HeLa細(xì)胞的宮頸癌裸鼠模型也具有明顯的抑瘤效果。除了HeLa之外，進(jìn)一步研究表明腺病毒載體裝載的hTERTC27多肽片段對于接種U87-MG人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的裸鼠模型也產(chǎn)生了同樣明顯的抑瘤效果。因此，hTERTC27做為新型構(gòu)建的抗腫瘤多肽，具有良好的應(yīng)用前景。但是，hTERTC27是否對人鼻咽癌C666具有抗腫瘤效應(yīng)，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究報道。 本研究以Egr-1啟動子作為橋梁，將hTERTC27片段構(gòu)建在Egr-1啟動子下游，通過5-FU誘導(dǎo)hTERTC27高表達(dá)。觀察5-FU誘導(dǎo)Egr-1啟動子驅(qū)動的hTERTC27（簡稱Egr-hTERTC27）聯(lián)合5-FU對鼻咽癌的體內(nèi)外抑瘤效應(yīng)，并初步探討其作用機(jī)制。本研究首次以Egr-1啟動子作為橋梁，以5-FU作為誘導(dǎo)劑，將hTERTC27片段聯(lián)合5-FU對鼻咽癌進(jìn)行基因-化療雙重治療，為鼻咽癌腫瘤治療提供一種新的治療方案。 方法 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法建立穩(wěn)定細(xì)胞株，采用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot方法觀察5-FU對Egr-1啟動子的誘導(dǎo)效應(yīng)。采用MTT法、細(xì)胞克隆形成實驗、AnnexinV/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，以及Tunel技術(shù)觀察Egr-hTERTC27聯(lián)合5-FU對鼻咽癌C666-1細(xì)胞的體外協(xié)同抑瘤效應(yīng)。采用穩(wěn)定細(xì)胞株建立鼻咽癌皮下移植瘤模型，通過腫瘤生長曲線、瘤重和HE染色觀察二者體內(nèi)協(xié)同抑瘤效應(yīng)。采用Western blot分析觀察凋亡激活相關(guān)蛋白如剪切的PARP、caspase-3、 caspase-9的表達(dá)以及Bcl-2抑凋亡蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 體外實驗結(jié)果表明，5-FU可以成功誘導(dǎo)Egr-1啟動子下游目的基因hTERTC27的高表達(dá)，5-FU誘導(dǎo)后的hTERTC27蛋白表達(dá)較對照組最多可增加7倍左右。過表達(dá)的hTERTC27能夠提高鼻咽癌C666-1細(xì)胞對5-FU的敏感性，并且進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖達(dá)20%。Egr-hTERTC27(Egr-1啟動子誘導(dǎo)過表達(dá)的hTERTC27)聯(lián)合5-FU可以協(xié)同抑制細(xì)胞增殖以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，聯(lián)合治療組的細(xì)胞凋亡率是hTERTC27單獨治療組的 4.8倍，是5-FU單獨治療組的1.8倍。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，Egr-hTERTC27聯(lián)合5-FU協(xié)同地抑制腫瘤生長速度、腫瘤重量，并且降低腫瘤的局部浸潤。此外，聯(lián)合治療組凋亡激活相關(guān)蛋白如剪切的PARP、caspase-3、 caspase-9蛋白表達(dá)增加，抑凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)減少。 結(jié)論 Egr-1啟動子介導(dǎo)的hTERTC27過表達(dá)(Egr-hTERTC27)聯(lián)合化療藥物5-FU能夠協(xié)同抑制鼻咽癌的生長并促進(jìn)其凋亡，對鼻咽癌具有很好的治療效果。這些結(jié)果提示我們，Egr-hTERTC27聯(lián)合5-FU可能作為鼻咽癌治療的一種新途徑。 2TCF3抑制小鼠胚胎癌生長的實驗研究 研究背景 胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells，ES細(xì)胞）來源于囊胚發(fā)育的內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)（InnerCell Mass），是一種高度未分化的干細(xì)胞。ES細(xì)胞可以自我更新、無限增殖并且具有多分化潛能，能夠分化成體內(nèi)所有組織和器官。ES細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為生物發(fā)育調(diào)控的研究以及組織生物學(xué)工程的研究帶來深遠(yuǎn)的影響。但是由于ES細(xì)胞研究受到倫理和道德的 約束，很大程度上限制ES細(xì)胞的研究。 胚胎癌(Embryonic carcinoma，EC)細(xì)胞是一種高度惡性的腫瘤細(xì)胞，是一種來源于惡性畸胎瘤的干細(xì)胞。它既屬于一種腫瘤干細(xì)胞，又與ES細(xì)胞類似，具有相近的組織學(xué)起源以及生物學(xué)特性。由于EC細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞以及ES細(xì)胞之間存在許多相似性，EC細(xì)胞越來越受到廣大干細(xì)胞研究者的青睞。ES細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制錯綜復(fù)雜，其具體機(jī)制尚不清楚晰，進(jìn)一步探索EC細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，對于正確理解EC及ES細(xì)胞的發(fā)育生物學(xué)特性及其應(yīng)用具有重要的意義。 Wnt信號通路途徑在ES細(xì)胞中扮演重要角色，它可以調(diào)節(jié)多種ES細(xì)胞的自我更新能力和分化潛能。它能夠調(diào)節(jié)Oct-3/4、Nanog等重要干性基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)ES細(xì) 胞在皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)的命運決定。此外，Wnt能夠上調(diào)BMP家族蛋白的表達(dá)，抑制ES細(xì)胞向神經(jīng)的分化等。T細(xì)胞因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）家族蛋白是Wnt家族蛋白最終的效應(yīng)分子，它具有一個保守的HMG結(jié)構(gòu)域和與β-連環(huán)蛋白（β-catenin）相互作用的結(jié)構(gòu)域。Wnt信號途徑的活化促使β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中積累，并且進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF家族蛋白相互作用，進(jìn)一步調(diào)節(jié)靶基因如c-Myc、Cyclin D1等的表達(dá)。TCF/LEF是一類具有雙向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子。一方面，它可以和CtBP以及Groucho蛋白結(jié)合從而抑制基因轉(zhuǎn)錄。另一方面，它可以結(jié)合β-catenin從而促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。 TCF家族蛋白有四種，，包括TCF1-4，其中TCF3在ES細(xì)胞中表達(dá)含量最高。最近研究表明TCF3在ES細(xì)胞中可以和TLE2形成抑制復(fù)合物，共定位在干性基因Oct4，Nanog的啟動子上，是Oct4和Nanog核心調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中非常重要的組成部分。TCF3的缺失可以增加Oct4和Nanog等其他ES轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，并且使ES細(xì)胞具有抵抗分化的潛能。正常情況下，體外培養(yǎng)的小鼠ES細(xì)胞需要在外源性白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF)的作用下才能保持自我更新的能力，將TCF3去除可以使小鼠ES細(xì)胞在沒有LIF的條件下也可以進(jìn)行自我更新，并且在分化刺激條件下出現(xiàn)分化遲緩。多項研究表明TCF3在維持ES細(xì)胞的增殖和自我更新能力中意義重要，但是其在EC細(xì)胞中的作用以及具體機(jī)制尚不明確。 本研究目的在于觀察TCF3在EC腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用并初步探討其作用機(jī)制。本研究首次探討TCF3在EC中的作用，為進(jìn)一步理解干細(xì)胞和EC的調(diào)控機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)。 方法 采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒重組載體，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝感染技術(shù)建立TCF3穩(wěn)定過表達(dá)的F9胚胎癌細(xì)胞株。Western blot和RT-PCR分析鑒定穩(wěn)定細(xì)胞株的建立。應(yīng)用TCF3過表達(dá)的F9胚胎癌細(xì)胞株進(jìn)行體外研究，細(xì)胞計數(shù)法、MTT比色法以及軟瓊脂克隆形成實驗觀察TCF3過表達(dá)對F9細(xì)胞增殖能力的影響。細(xì)胞遷移實驗觀察TCF3過表達(dá)對F9細(xì)胞遷移能力的影響。采用穩(wěn)定細(xì)胞株建立小鼠胚胎癌皮下移植瘤模型，通過腫瘤生長曲線、瘤重、生存率以及HE染色觀察TCF3過表達(dá)對胚胎癌生長的影響。采用細(xì)胞免疫熒光和Western blot法觀察Oct4在F9細(xì)胞中的表達(dá)。采用RT-PCR和Western blot分析法觀察TCF3過表達(dá)對Oct4基因mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的影響。采用RNAi技術(shù)觀察TCF3干涉沉默后對Oct4表達(dá)的影響。 結(jié)果 體外實驗結(jié)果表明TCF3過表達(dá)顯著抑制F9細(xì)胞株的增殖、克隆形成和遷移能力，抑制率分別達(dá)到約30%、45%和30%。體內(nèi)小鼠移植瘤模型結(jié)果表明TCF3過表達(dá)顯著抑制腫瘤體積大小(36.4%)、腫瘤重量(34.8%)、腫瘤惡性程度進(jìn)程和腫瘤局部浸潤，以及延長了荷瘤小鼠的生存時間。F9胚胎癌中TCF3的過表達(dá)能夠下調(diào)Oct4蛋白的表達(dá)。相反，siRNA干涉TCF3的表達(dá)能夠上調(diào)Oct4的表達(dá)。 結(jié)論 TCF3過表達(dá)能夠抑制小鼠F9胚胎癌的生長，其機(jī)制可能是因為下調(diào)Oct4蛋白的表達(dá)。本研究所采用的技術(shù)路線及實驗結(jié)果在國內(nèi)外均未見報道。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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1 凌春華,季成,陳延斌,傅建新,陳衛(wèi)昌,楊吉成,蘇燎原;內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)移聯(lián)合電離輻射對肺腺癌移植瘤生長的影響[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2004年10期

2 魏道嚴(yán),戴冰冰,陳詩書;放射誘導(dǎo)經(jīng)Egr-1啟動子調(diào)控的腺病毒介導(dǎo)CDglyTK基因的腫瘤靶向表達(dá)[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2001年16期

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本文編號：1494398