發(fā)布時間：2018-02-02 05:00

  本文關(guān)鍵詞： polybrene 耳毒性 耳蝸 慢病毒 基因轉(zhuǎn)染 順鉑 凋亡 自噬 耳蝸 銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 順鉑 耳蝸　出處：《上海交通大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分Polybrene對慢病毒載體耳蝸細(xì)胞的轉(zhuǎn)染作用目的:觀察病毒轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑polybrene的耳毒性作用并進(jìn)一步探討其對慢病毒轉(zhuǎn)染耳蝸細(xì)胞,特別是轉(zhuǎn)染耳蝸毛細(xì)胞的作用。材料和方法:采用新生大鼠耳蝸基底膜培養(yǎng)的方法,應(yīng)用0.1-10μg/ml polybrene處理耳蝸基底膜24小時,觀察毛細(xì)胞形態(tài)、缺失率,并進(jìn)一步評估polybrene對耳蝸細(xì)胞的安全濃度。其中,采用TUNEL和碘化丙啶染色觀察2μg/ml polybrene作用后毛細(xì)胞的凋亡與壞死情況。慢病毒載體轉(zhuǎn)染耳蝸細(xì)胞效率的測定采用不同濃度的慢病毒載體與耳蝸基底膜共培養(yǎng)24小時后,更換不含病毒載體的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48小時。評估各組耳蝸細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率后,選擇最適慢病毒濃度,聯(lián)合應(yīng)用安全濃度的polybrene,觀察polybrene對慢病毒載體轉(zhuǎn)染耳蝸細(xì)胞的作用。結(jié)果:不同濃度polybrebe基底膜培養(yǎng)24小時發(fā)現(xiàn):對照組毛細(xì)胞形態(tài)良好,0.1μg/ml組毛細(xì)胞形態(tài)基本接近對照組。0.5μg/ml組毛細(xì)胞纖毛輕度破壞,并出現(xiàn)零散的毛細(xì)胞缺失;當(dāng)濃度增加到1μg/ml時,內(nèi)外毛細(xì)胞纖毛明顯倒伏,中度毛細(xì)胞缺失。當(dāng)濃度達(dá)2μg/ml和5μg/ml時,毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂、大量毛細(xì)胞缺失,殘存的毛細(xì)胞纖毛部分或全部丟失,后者更為嚴(yán)重。當(dāng)濃度增加到10μg/ml,毛細(xì)胞罕見。各組內(nèi)外毛細(xì)胞平均缺失率顯示:與對照組相比,0.1μg/ml組內(nèi)外毛細(xì)胞雖然有少量缺失,但是差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(多樣本秩和檢驗,兩兩比較,P0.05)。0.5μg/ml polybrebe引起外毛細(xì)胞輕度缺失,與對照組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(多樣本秩和檢驗,兩兩比較,P0.05)。濃度超過0.5μg/ml后,各組內(nèi)外毛細(xì)胞缺失率與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(多樣本秩和檢驗,兩兩比較,P0.05)。碘化丙啶染色顯示毛細(xì)胞細(xì)胞核呈碎片狀、濃染,TUNEL凋亡檢測未見陽性。周圍支持細(xì)胞胞核形態(tài)良好。不同濃度慢病毒轉(zhuǎn)染后平均GFP陽性細(xì)胞數(shù)目分別為62.75±18.65(1×106 IU),196.83±22.34(5×106 IU),205.42±5.74(1×107 IU),1×107 IU慢病毒聯(lián)合0.1μg/ml polybrene后平均GFP陽性細(xì)胞數(shù)目為247.44±13.51,與未聯(lián)合polybrene相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(單因素方差分析,Bonferroni檢驗,P0.05)。各組均未見毛細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。結(jié)論:0.1μg/ml polybrene對耳蝸毛細(xì)胞較為安全,0.5-10μg/ml polybrene對耳蝸毛細(xì)胞損傷呈劑量依賴性,并以細(xì)胞壞死方式導(dǎo)致細(xì)胞死亡,但對支持細(xì)胞無損傷。0.1μg/ml polybrene可以促進(jìn)慢病毒載體對耳蝸基底膜除毛細(xì)胞以外的支持細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,但無論是否聯(lián)合應(yīng)用polybrene,慢病毒載體僅轉(zhuǎn)染耳蝸基底膜支持細(xì)胞,不能轉(zhuǎn)染耳蝸毛細(xì)胞。Polybrene可用于慢病毒載體對耳蝸基底膜支持細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。第二部分細(xì)胞自噬在順鉑耳毒性中的作用目的:探討在離體耳蝸器官培養(yǎng)條件下,不同濃度順鉑對耳蝸細(xì)胞的損傷規(guī)律及其機(jī)制。材料和方法:采用新生大鼠耳蝸基底膜體外培養(yǎng)技術(shù),應(yīng)用不同濃度的順鉑與基底膜共培養(yǎng)48小時,熒光顯微鏡下觀察各組毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)形態(tài),繪制耳蝸毛細(xì)胞圖并計數(shù)毛細(xì)胞缺失率,并應(yīng)用透射電鏡觀察各組毛細(xì)胞與螺旋神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu),應(yīng)用免疫印跡檢測各組自噬蛋白beclin1表達(dá)情況,以及應(yīng)用10μM順鉑與基底膜共培養(yǎng)24小時、48小時、72小時,通過TUNEL法檢測各時間點耳蝸細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:離體耳蝸器官培養(yǎng)條件下,對照組毛細(xì)胞形態(tài)良好;10μM順鉑組毛細(xì)胞排列紊亂,內(nèi)外毛細(xì)胞約70%毛細(xì)胞缺失;100μM順鉑組導(dǎo)致毛細(xì)胞形態(tài)大量破壞,形成細(xì)胞碎片,內(nèi)外毛細(xì)胞缺失達(dá)90%以上;與對照組相比,400μM順鉑毛細(xì)胞形態(tài)良好,數(shù)目未見明顯缺失。對照組神經(jīng)纖維束清晰可見,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞體形狀規(guī)則;10μM組神經(jīng)纖維大量減少,相對應(yīng)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞亦大量缺失,殘留的神經(jīng)纖維和節(jié)細(xì)胞形態(tài)尚可;100μM組神經(jīng)纖維和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)一步加重,這些神經(jīng)纖維明顯纖細(xì),相對應(yīng)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞體形態(tài)不規(guī)則;與對照組相比,400μM組神經(jīng)纖維和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目未見明顯缺失,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞體形態(tài)規(guī)則,但胞體體積變小。在透射電鏡下,10μM順鉑組見毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)具有典型的凋亡特征即核固縮、核碎裂;400μM組毛細(xì)胞線粒體稍腫脹,其與對照組毛細(xì)胞內(nèi)均可見雙側(cè)膜包繞的自噬體,二者的螺旋神經(jīng)節(jié)均未見明顯病變。自噬蛋白beclin1表達(dá)水平隨順鉑濃度增加具有先減少后而增加的趨勢。TUNEL檢測顯示10μM順鉑與基底膜共培養(yǎng)24小時未見毛細(xì)胞凋亡,48小時后可見毛細(xì)胞大量凋亡,72小時后幾乎所有毛細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)論:離體耳蝸器官培養(yǎng)條件下,順鉑耳毒性并不是濃度依賴性的,低濃度順鉑對毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)具有明顯損傷作用,這種損傷主要由細(xì)胞凋亡引起,而高濃度順鉑未見明顯細(xì)胞損傷,可能與自噬的激活有關(guān),自噬的激活減緩了順鉑耳毒性,對毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)具有保護(hù)作用。第三部分銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在耳蝸組織中的表達(dá)目的:觀察銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2在耳蝸組織中的定位表達(dá),并進(jìn)一步探討順鉑對銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1和銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2表達(dá)的影響。材料和方法:應(yīng)用耳蝸基底膜分離取材技術(shù),取出生后3-5天的大鼠耳蝸基底膜組織固定,采用銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2免疫熒光染色和鬼筆環(huán)肽復(fù)染,觀察銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2的表達(dá)及定位情況。并采用耳蝸器官離體培養(yǎng)技術(shù),離體耳蝸器官與10μM順鉑共培養(yǎng)48小時后,用免疫印跡法檢測銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1和銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2的表達(dá)情況。結(jié)果:毛細(xì)胞和血管紋邊緣細(xì)胞的胞漿內(nèi)可見銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2免疫熒光染色陽性;免疫印跡法結(jié)果顯示對照組和10μM順鉑組均可見銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá),應(yīng)用10μM順鉑培養(yǎng)48小時后銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá)未見明顯變化,兩組均未檢測到銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2表達(dá)。結(jié)論:銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1和銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2均在耳蝸組織中表達(dá),其中銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2在耳蝸毛細(xì)胞和血管紋邊緣細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R764

【參考文獻(xiàn)】

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1 丁大連;亓衛(wèi)東;張梅;王蘋;蔣海燕;Richard Salvi;;順鉑及其耳毒性[J];中華耳科學(xué)雜志;2008年02期

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本文編號：1483682