本文關(guān)鍵詞： Behcet病 Vogt-小柳原田綜合征 Fuchs綜合征 微小RNA 單核苷酸多態(tài)性　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景 葡萄膜炎是一類由感染因素、免疫反應(yīng)等引起的眼內(nèi)脈絡(luò)膜組織的炎癥，好發(fā)生于青壯年，易反復(fù)發(fā)作，是常見的致盲眼病之一,也被稱為眼內(nèi)炎癥。目前葡萄膜炎的臨床類型和病因多達(dá)100余種，而其中，Behcet病、Vogt-小柳原田綜合征這兩類疾病為我國致盲率最高的葡萄膜炎類型，而Fuchs綜合征這類疾病則是一種致盲率低的葡萄膜炎類型。Behcet病、Vogt-小柳原田綜合征目前普遍被認(rèn)為主要是由自身免疫反應(yīng)所介導(dǎo)的疾病，而Fuchs綜合征目前報道顯示與病毒感染相關(guān)。 microRNA（微小RNA，miRNA）是一類保守的小分子非編碼RNA。miRNA能與特異性的信使RNAs （mRNAs）的3’端非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）互補(bǔ)結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，降解靶基因或者抑制轉(zhuǎn)錄后的翻譯。目前研究顯示miRNAs在免疫功能和自身免疫的調(diào)節(jié)以及病毒感染中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。 本研究正是基于上述背景，進(jìn)行了以下兩大方面的實驗：1.探討五種免疫相關(guān)的microRNAs在Behcet病和Vogt-小柳原田綜合征這兩類自身免疫性疾病中的作用機(jī)制；2.探討miR-146a和轉(zhuǎn)錄因子Ets-1基因多態(tài)是否與中國漢族人群Behcet�。˙D）、Vogt-小柳原田綜合征（VKH）和Fuchs’綜合征（FUS）相關(guān)。通過上述研究，以期能對葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制有一個更深入的認(rèn)識，同時為其防治尋找新的靶點。 第一部分MiRNAs在Behcet病發(fā)病中作用 目的： microRNAs（miRNAs）在免疫調(diào)節(jié)和哺乳動物免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。在本文中，，我們研究了microRNAs在Behcet病和Vogt-小柳原田綜合征這兩類自身免疫性疾病中的作用機(jī)制。 方法： 1.分別抽取活動期、靜止期的Behcet病、VKH綜合征患者和正常人外周靜脈血，并分離這些患者和正常人外周血單個核細(xì)胞（PBMC）、CD4+T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC）。 2.抽提細(xì)胞總RNA，運用TaqMan定量PCR的方法檢測外周血單個核細(xì)胞（PBMC）、CD4+T細(xì)胞和DC中五種與免疫相關(guān)的microRNAs的表達(dá)水平。 3.體外用miRNA-155mimics和miRNA-155inhibitor分別轉(zhuǎn)染DC，運用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后的DC與成熟度相關(guān)的表面分子標(biāo)記物（CD80, CD40, CD83, CD86和HLA-DR）的表達(dá)水平。 4.采用ELISA方法檢測轉(zhuǎn)染后的DC分泌的細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-1β的表達(dá)水平。 5.體外共培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的DC和CD4+T細(xì)胞，運用流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子IL-17的表達(dá)水平 6.運用miRNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA-155的靶基因，再運用雙熒光素酶報告基因的檢測方法驗證miRNA-155對預(yù)測的靶基因的3’UTR區(qū)域的熒光素酶抑制作用，最后用Western Blot的方法進(jìn)一步確認(rèn)miRNA-155對靶基因的調(diào)控作用。 結(jié)果： 1.活動期Behcet病患者的PBMC和DC中miRNA-155的表達(dá)水平顯著低于正常人，而活動期VKH患者的PBMC、活動期Behcet病患者的CD4+T細(xì)胞以及靜止期Behcet病患者的PBMC和DC中這五種miRNAs水平與正常人相比均沒有統(tǒng)計學(xué)差異。 2.體外能成功將miRNA-155mimic及miRNA-155inhibitor轉(zhuǎn)染入DC中，并且轉(zhuǎn)染了miRNA-155mimic及miRNA-155inhibitor的DC能分別高表達(dá)和低表達(dá)miRNA-155。 3.轉(zhuǎn)染miRNA-155mimic及miRNA-155inhibitor后的DC，其成熟度沒有統(tǒng)計學(xué)差異。 4.轉(zhuǎn)染miRNA-155mimics后的DC分泌的促炎因子IL-6呈現(xiàn)顯著低表達(dá)，而抑炎因子IL-10、IL-1β則呈現(xiàn)顯著高表達(dá)；而轉(zhuǎn)染miRNA-155inhibitor后的DC分泌的促炎因子IL-6呈現(xiàn)顯著高表達(dá)，而抑炎因子IL-10、IL-1β則呈現(xiàn)顯著低表達(dá)。 5.轉(zhuǎn)染了miRNA-155mimics的DC共培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞中，炎癥因子IL-17顯著低表達(dá)；而在與轉(zhuǎn)染了miRNA-155inhibitor的DC共培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞中，炎癥因子IL-17顯著高表達(dá)。 6.通過綜合多個生物信息學(xué)預(yù)測網(wǎng)站和軟件的預(yù)測結(jié)果，我們根據(jù)miRNA-155保守的核苷酸序列預(yù)測到了其在人TAB2基因的3’UTR區(qū)域有一個可能的靶位點。miR-155能夠結(jié)合到TAB23’UTR區(qū)域而抑制熒光素酶的表達(dá)。 7.轉(zhuǎn)染了miR-155mimics的DC中TAB2蛋白的表達(dá)量顯著下降，而轉(zhuǎn)染了miR-155inhibitor的DC中TAB2蛋白的表達(dá)量明顯上調(diào)，兩者均以GAPDH作為內(nèi)參來均衡蛋白的上樣量。該結(jié)果表明miR-155能夠直接調(diào)控靶基因TAB2的蛋白水平表達(dá)。 結(jié)論： 我們的研究發(fā)現(xiàn)在活動期Behcet病患者中miR-155顯著低表達(dá)。而在這類疾病中這種下調(diào)的miR-155水平是通過調(diào)節(jié)DC和DC4+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子而發(fā)揮作用的，并且這個調(diào)節(jié)作用是通過miR-155調(diào)控了靶基因TAB2而實現(xiàn)的。 第二部分MiRNAs與Behcet病、Vogt-小柳原田綜合征和Fuchs綜合征遺傳易感性研究 目的： 本實驗旨在探討miR-146a和轉(zhuǎn)錄因子Ets-1基因多態(tài)是否與中國漢族人群Behcet�。˙D）、Vogt-小柳原田綜合征（VKH）和Fuchs’綜合征（FUS）相關(guān)。 方法： 1.運用PCR-RFLP和測序的方法對669例BD患者的miR-146a和Ets-1基因的三個多態(tài)位點（miR-146a/rs2910164, ets-1/rs1128334和rs10893872）進(jìn)行了基因分型。 2.運用PCR-RFLP和測序的方法分別對613例VKH患者的miR-146a和Ets-1基因的三個多態(tài)位點（miR-146a/rs2910164,ets-1/rs1128334和rs10893872）進(jìn)行了基因分型。 3.運用PCR-RFLP和測序的方法分別對219例FUS患者的miR-146a和Ets-1基因的三個多態(tài)位點（miR-146a/rs2910164,ets-1/rs1128334和rs10893872）進(jìn)行了基因分型。 4.運用PCR-RFLP和測序的方法分別對1132例正常人的miR-146a和Ets-1基因的三個多態(tài)位點（miR-146a/rs2910164,ets-1/rs1128334和rs10893872）進(jìn)行了基因分型。 5.運用定量PCR的方法檢測miR-146a/rs2910164位點三種基因型的正常人PBMCs細(xì)胞中miR-146a表達(dá)水平。 6.運用ELISA的方法檢測miR-146a/rs2910164位點三種基因型的正常人PBMCs培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子（IL-17、IL-1β、IL-6、IL-8和MCP-1）的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.正常人的miR-146a和Ets-1基因的3個SNP的分型結(jié)果都符合哈迪溫伯格平衡（p0.05）。BD患者的miR-146a基因的rs2910164CC基因型和顯著低于正常對照組(pc=2.19×10~-5, OR0.61)，而GC基因型頻率則顯著高于正常對照組（pc=0.009, OR1.38)；rs2910164C等位基因的頻率也顯著低于正常對照組（pc=9.3×10~-5, OR0.75）。 2.定量PCR結(jié)果顯示：rs2910164基因GG基因型的正常人PBMC細(xì)胞中miR-146a基因的表達(dá)水平是CC型中miR-146a表達(dá)的2.45倍，是GC型中miR-146a表達(dá)的1.99倍。 3. ELISA結(jié)果顯示：IL-17和IL-1β表達(dá)在rs2910164基因CC基因型的正常人PBMC培養(yǎng)上清中顯著低于GG基因型。IL-6和MCP-1的表達(dá)水平在三個基因型中沒有統(tǒng)計學(xué)差異。而IL-8在rs2910164基因CC基因型的正常人PBMC培養(yǎng)上清中則顯示出輕微上調(diào)的表達(dá)。 4. Ets-1基因的2個SNP rs1128334和rs10893872，各位點基因型和等位基因的頻率分布在BD病患者和正常對照組之間均統(tǒng)計學(xué)差異。miR-146a和Ets-1基因3個SNP的等位基因與BD患者主要臨床癥狀也沒有統(tǒng)計學(xué)差異。 5.正常人的miR-146a和Ets-1基因的3個SNP的分型結(jié)果都符合哈迪溫伯格平衡（p0.05）。miR-146a和Ets-1基因3個SNP的等位基因與VKH患者主要臨床癥狀沒有統(tǒng)計學(xué)差異。VKH患者的miR-146a和Ets-1基因3個SNP的等位基因、基因型頻率與正常對照組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異。 6.正常人的miR-146a和Ets-1基因的3個SNP的分型結(jié)果都符合哈迪溫伯格平衡（p0.05）。FUS患者的miR-146a和Ets-1基因3個SNP的等位基因、基因型頻率與正常對照組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論： miR-146a基因的rs2910164與中國漢族人群中BD疾病發(fā)病有關(guān)。rs2910164CC基因型和C等位基因可能是BD疾病的保護(hù)基因。miR-146a和Ets-1基因多態(tài)與VKH和FUS無相關(guān)性。
[Abstract]:background
Is a kind of uveitis by infection, inflammation and intraocular choroidal tissue caused by the immune response, good Yu Qing young, easy to repeated attacks, is one of the common causes of blindness, also known as intraocular inflammation. At present the clinical type and etiology of uveitis as many as 100 species, of which, the two types of Behcet disease. The highest rate of uveitis disease for our blindness Vogt- Liu Yuantian syndrome, and Fuchs syndrome of this disease is a kind of blindness low rate of uveitis in.Behcet disease, Vogt- Liu Yuantian syndrome has been generally considered mainly by autoimmune mediated diseases, and Fuchs syndrome reported at present associated with virus infection.
MicroRNA (micro RNA, miRNA) is a class of small molecule non conserved encoding RNA.miRNA can bind to specific target messenger RNAs (mRNAs) in the 3 'untranslated region (untranslated, region, UTR) complementary combination, and expression in the post transcriptional regulation of target genes and degradation of target genes or inhibit transcription after translation at present studies show that miRNAs plays a key role in immune function and immune regulation and virus infection.
This study is based on the above background, the following two aspects: 1. to study experimental microRNAs five kinds of immune related in Behcet disease and Vogt- Liu Yuantian syndrome mechanism of these two types of autoimmune diseases; 2. of miR-146a and transcription factor Ets-1 gene polymorphism and Behcet disease (BD Chinese Han population), Vogt- Liu Yuantian syndrome (VKH) and Fuchs syndrome (FUS). Through the above research, the pathogenesis of uveitis in order to have a more in-depth understanding, at the same time to find new targets for the prevention and treatment.
Part 1 the role of MiRNAs in the pathogenesis of Behcet disease
Objective:
MicroRNAs (miRNAs) plays an important regulatory role in immune regulation and mammalian immune response. In this paper, we studied the mechanism of microRNAs in two kinds of autoimmune diseases, Behcet disease and Vogt- small Liu Yuantian syndrome.
Method錛

本文編號：1464082