本文關鍵詞：Notch信號通路在人胚胎干細胞分化為毛細胞的無基質(zhì)細胞誘導體系中的研究　出處：《浙江大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：聽力損失是嚴重影響人類生活質(zhì)量的世界性頑疾之一,目前尚無根治的方法。雖然聽力損傷對生命不造成威脅,但耳聾發(fā)病率日益增加嚴重影響患者的生活質(zhì)量和社會交流能力,給全球的經(jīng)濟發(fā)展帶來了嚴重的影響。內(nèi)耳是一個具有復雜結構且高度特化的感覺器官。內(nèi)耳毛細胞是內(nèi)耳中重要的聽覺感受器。在人的內(nèi)耳中,毛細胞容易受到年齡、耳毒性藥物、家族遺傳疾病、傳染性疾病和噪音等因素影響而損傷。內(nèi)耳毛細胞為終末分化細胞,基本上不具有再生修復能力,由毛細胞損傷引起的感音神經(jīng)性耳聾往往是不可逆的,造成永久性的耳聾,目前尚無有效的方法從根本上治愈耳聾。因此,對耳聾相關的機制研究和干預治療迫在眉睫。近幾年來,干細胞工程的興起為感音神經(jīng)性耳聾的治療提供了一種新思路。以干細胞誘導分化為基礎,利用干細胞相關技術,探討聽覺系統(tǒng)損傷修復特別是毛細胞的損傷和再生已成為可能,有望從根本上解決聽力損傷問題。胚胎干細胞是內(nèi)耳毛細胞再生的重要種子細胞之一。研究證明胚胎干細胞在體外培養(yǎng)條件下仍具有多分化潛能,在合適的誘導條件下可以分化為毛細胞。但是在胚胎干細胞及毛細胞的相關研究中依舊存在很多問題。主要包括：1、需要建立一個簡便、高效的將人胚胎干細胞體外誘導分化為內(nèi)耳祖細胞的體系。2、人胚胎干細胞體外成功分化為毛細胞的誘導體系主要建立在基質(zhì)細胞共培養(yǎng)的基礎上,與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)會對再生毛細胞的后續(xù)檢測和進一步研究造成一定的干擾。3、Notch信號通路在哺乳動物內(nèi)耳毛細胞的發(fā)育過程中起著非常重要的作用,然而,Notch信號通路毛細胞體外誘導分化過程中是否具有類似的作用?還未可知。因此,本研究的前兩部分內(nèi)容(即第二章和第三章)主要研究如何在在無基質(zhì)細胞作為飼養(yǎng)層的前提條件下,成功將人胚胎干細胞分化為具有典型靜纖毛束和電生理反應的成熟毛細胞。第三部分(第四章),以人胚胎干細胞向毛細胞樣細胞體外定向分化的無基質(zhì)細胞誘導體系為基礎,進而研究Notch信號通路中的配體和受體對毛細胞體外誘導分化的影響。第一部分：本研究分別采取了擬胚體組合因子誘導法與單層貼壁誘導法將人胚胎細胞向內(nèi)耳祖細胞誘導分化,均獲得了能夠表達內(nèi)耳前體細胞標志基因和蛋白的內(nèi)耳祖細胞。這兩種誘導方法相比,擬胚體懸浮培養(yǎng)法需要分階段操作,且誘導階段耗時相比于單層貼壁誘導法長,因此,我們以單層貼壁誘導法為基礎,建立了人胚胎干細胞定向分化為內(nèi)耳祖細胞的體系,為后續(xù)進一步向內(nèi)耳毛細胞誘導分化奠定了研究基礎。第二部分：為了將分化得到的內(nèi)耳祖細胞進一步誘導分化為具有功能的毛細胞。我們嘗試采用不同的基質(zhì)和誘導培養(yǎng)液,將分離得到的內(nèi)耳上皮祖細胞(OEPs)向毛細胞樣的細胞誘導分化。實驗結果表明：以滅活的雞胚橢圓囊基質(zhì)細胞作為飼養(yǎng)層,誘導OEPs分化生成的毛細胞表面存在規(guī)則排列的靜纖毛束。然而,和基質(zhì)細胞共培養(yǎng),分化得到的毛細胞中參雜有基質(zhì)細胞,這將對后續(xù)的檢測和研究工作造成一定的干擾。為了避免基質(zhì)細胞的干擾,我們采用層粘連蛋白laminin作為基質(zhì)替代雞胚橢圓囊基質(zhì)細胞,嘗試采用不同的誘導培養(yǎng)液將OEPs誘導分化為有功能的毛細胞。結果表明：將OEPs接種在laminin預處理過的培養(yǎng)皿上,用添加了EGF和RA的雞胚橢圓囊基質(zhì)細胞的條件培養(yǎng)液作為誘導培養(yǎng)液誘導OEPs向毛細胞分化,生成的毛細胞表面存在成束的規(guī)則排列的靜纖毛,并經(jīng)膜片鉗檢測證明具有電生理功能。這提示我們,在無基質(zhì)細胞共培養(yǎng)的條件下,人胚胎干細胞在體外可以誘導分化為具有功能的成熟毛細胞。第三部分：在體內(nèi),內(nèi)耳毛細胞的發(fā)育過程受到Notch信號通路的調(diào)控,在體外誘導分化過程中,毛細胞的分化和發(fā)育是否也受到Notch信號通路類似的調(diào)控作用,卻鮮有研究。了解內(nèi)耳毛細胞體外分化過程中Notch信號通路的調(diào)控作用有助于控制毛細胞的分化。我們以人胚胎干細胞向毛細胞樣細胞體外定向分化的無基質(zhì)細胞誘導體系為基礎,進而研究Notch信號通路中的配體和受體對毛細胞體外誘導分化的影響。首先,檢測Notch信號通路中各配體和受體在毛細胞誘導分化不同階段的表達情況,確定Notch信號的表達時序；再依據(jù)配體表達的時序,選取在誘導分化過程中不同配體開始表達時的細胞作為靶細胞；用pAJ-U6-shRNA-CMV-Puro/GFP載體,構建Jag-1-shRNA干擾載體的慢病毒分別感染分化6天和分化12天的祖細胞以沉默Jag-1基因。同時,用Jag-2-shRNA和Dll-1-shRNA干擾載體的慢病毒感染分化5天的毛細胞以沉默Jag-2和DlM基因,最后,通過半定量PCR、免疫熒光檢測和電鏡檢測驗證沉默Jag-1,Jag-2和Dll-1基因?qū)γ毎w外誘導分化的影響。實驗結果表明：在hESCs向毛細胞體外誘導分化的體系中,Jag-1配體主要參與內(nèi)耳祖細胞的體外分化的過程。而Jag-2配體和Dll-1配體主要參與毛細胞的體外分化的過程,并對毛細胞的分化和發(fā)育起著一定的抑制作用。當Jag-2配體和Dll-1配體單獨受到干擾時,對毛細胞體外分化的影響不顯著,而當兩者同時受到干擾時,較為明顯地促進毛細胞的體外分化,且抑制了支持細胞的分化。因此,我們認為Jag-2配體和Dll-1配體可能是協(xié)同作用的。本章研究主要是為進一步研究毛細胞的體外誘導體系中Notch信號通路的作用機制奠定了一定的理論基礎。
[Abstract]:In recent years , it is necessary to establish a simple and efficient system for the induction and differentiation of human embryonic stem cells into inner ear progenitor cells . In order to avoid the interference of stromal cells , we used laminin as a matrix to replace chicken embryo oval cell matrix cells .

【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R764

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本文編號：1441552