本文關(guān)鍵詞：Notch信號(hào)通路在人胚胎干細(xì)胞分化為毛細(xì)胞的無(wú)基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)體系中的研究　出處：《浙江大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：聽(tīng)力損失是嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量的世界性頑疾之一,目前尚無(wú)根治的方法。雖然聽(tīng)力損傷對(duì)生命不造成威脅,但耳聾發(fā)病率日益增加嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和社會(huì)交流能力,給全球的經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重的影響。內(nèi)耳是一個(gè)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)且高度特化的感覺(jué)器官。內(nèi)耳毛細(xì)胞是內(nèi)耳中重要的聽(tīng)覺(jué)感受器。在人的內(nèi)耳中,毛細(xì)胞容易受到年齡、耳毒性藥物、家族遺傳疾病、傳染性疾病和噪音等因素影響而損傷。內(nèi)耳毛細(xì)胞為終末分化細(xì)胞,基本上不具有再生修復(fù)能力,由毛細(xì)胞損傷引起的感音神經(jīng)性耳聾往往是不可逆的,造成永久性的耳聾,目前尚無(wú)有效的方法從根本上治愈耳聾。因此,對(duì)耳聾相關(guān)的機(jī)制研究和干預(yù)治療迫在眉睫。近幾年來(lái),干細(xì)胞工程的興起為感音神經(jīng)性耳聾的治療提供了一種新思路。以干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為基礎(chǔ),利用干細(xì)胞相關(guān)技術(shù),探討聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)損傷修復(fù)特別是毛細(xì)胞的損傷和再生已成為可能,有望從根本上解決聽(tīng)力損傷問(wèn)題。胚胎干細(xì)胞是內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的重要種子細(xì)胞之一。研究證明胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下仍具有多分化潛能,在合適的誘導(dǎo)條件下可以分化為毛細(xì)胞。但是在胚胎干細(xì)胞及毛細(xì)胞的相關(guān)研究中依舊存在很多問(wèn)題。主要包括：1、需要建立一個(gè)簡(jiǎn)便、高效的將人胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳祖細(xì)胞的體系。2、人胚胎干細(xì)胞體外成功分化為毛細(xì)胞的誘導(dǎo)體系主要建立在基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)會(huì)對(duì)再生毛細(xì)胞的后續(xù)檢測(cè)和進(jìn)一步研究造成一定的干擾。3、Notch信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物內(nèi)耳毛細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中起著非常重要的作用,然而,Notch信號(hào)通路毛細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化過(guò)程中是否具有類似的作用?還未可知。因此,本研究的前兩部分內(nèi)容(即第二章和第三章)主要研究如何在在無(wú)基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層的前提條件下,成功將人胚胎干細(xì)胞分化為具有典型靜纖毛束和電生理反應(yīng)的成熟毛細(xì)胞。第三部分(第四章),以人胚胎干細(xì)胞向毛細(xì)胞樣細(xì)胞體外定向分化的無(wú)基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)體系為基礎(chǔ),進(jìn)而研究Notch信號(hào)通路中的配體和受體對(duì)毛細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的影響。第一部分：本研究分別采取了擬胚體組合因子誘導(dǎo)法與單層貼壁誘導(dǎo)法將人胚胎細(xì)胞向內(nèi)耳祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化,均獲得了能夠表達(dá)內(nèi)耳前體細(xì)胞標(biāo)志基因和蛋白的內(nèi)耳祖細(xì)胞。這兩種誘導(dǎo)方法相比,擬胚體懸浮培養(yǎng)法需要分階段操作,且誘導(dǎo)階段耗時(shí)相比于單層貼壁誘導(dǎo)法長(zhǎng),因此,我們以單層貼壁誘導(dǎo)法為基礎(chǔ),建立了人胚胎干細(xì)胞定向分化為內(nèi)耳祖細(xì)胞的體系,為后續(xù)進(jìn)一步向內(nèi)耳毛細(xì)胞誘導(dǎo)分化奠定了研究基礎(chǔ)。第二部分：為了將分化得到的內(nèi)耳祖細(xì)胞進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為具有功能的毛細(xì)胞。我們嘗試采用不同的基質(zhì)和誘導(dǎo)培養(yǎng)液,將分離得到的內(nèi)耳上皮祖細(xì)胞(OEPs)向毛細(xì)胞樣的細(xì)胞誘導(dǎo)分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：以滅活的雞胚橢圓囊基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層,誘導(dǎo)OEPs分化生成的毛細(xì)胞表面存在規(guī)則排列的靜纖毛束。然而,和基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng),分化得到的毛細(xì)胞中參雜有基質(zhì)細(xì)胞,這將對(duì)后續(xù)的檢測(cè)和研究工作造成一定的干擾。為了避免基質(zhì)細(xì)胞的干擾,我們采用層粘連蛋白laminin作為基質(zhì)替代雞胚橢圓囊基質(zhì)細(xì)胞,嘗試采用不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)液將OEPs誘導(dǎo)分化為有功能的毛細(xì)胞。結(jié)果表明：將OEPs接種在laminin預(yù)處理過(guò)的培養(yǎng)皿上,用添加了EGF和RA的雞胚橢圓囊基質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)液作為誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)OEPs向毛細(xì)胞分化,生成的毛細(xì)胞表面存在成束的規(guī)則排列的靜纖毛,并經(jīng)膜片鉗檢測(cè)證明具有電生理功能。這提示我們,在無(wú)基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下,人胚胎干細(xì)胞在體外可以誘導(dǎo)分化為具有功能的成熟毛細(xì)胞。第三部分：在體內(nèi),內(nèi)耳毛細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程受到Notch信號(hào)通路的調(diào)控,在體外誘導(dǎo)分化過(guò)程中,毛細(xì)胞的分化和發(fā)育是否也受到Notch信號(hào)通路類似的調(diào)控作用,卻鮮有研究。了解內(nèi)耳毛細(xì)胞體外分化過(guò)程中Notch信號(hào)通路的調(diào)控作用有助于控制毛細(xì)胞的分化。我們以人胚胎干細(xì)胞向毛細(xì)胞樣細(xì)胞體外定向分化的無(wú)基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)體系為基礎(chǔ),進(jìn)而研究Notch信號(hào)通路中的配體和受體對(duì)毛細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的影響。首先,檢測(cè)Notch信號(hào)通路中各配體和受體在毛細(xì)胞誘導(dǎo)分化不同階段的表達(dá)情況,確定Notch信號(hào)的表達(dá)時(shí)序；再依據(jù)配體表達(dá)的時(shí)序,選取在誘導(dǎo)分化過(guò)程中不同配體開(kāi)始表達(dá)時(shí)的細(xì)胞作為靶細(xì)胞；用pAJ-U6-shRNA-CMV-Puro/GFP載體,構(gòu)建Jag-1-shRNA干擾載體的慢病毒分別感染分化6天和分化12天的祖細(xì)胞以沉默Jag-1基因。同時(shí),用Jag-2-shRNA和Dll-1-shRNA干擾載體的慢病毒感染分化5天的毛細(xì)胞以沉默Jag-2和DlM基因,最后,通過(guò)半定量PCR、免疫熒光檢測(cè)和電鏡檢測(cè)驗(yàn)證沉默Jag-1,Jag-2和Dll-1基因?qū)γ?xì)胞體外誘導(dǎo)分化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在hESCs向毛細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的體系中,Jag-1配體主要參與內(nèi)耳祖細(xì)胞的體外分化的過(guò)程。而Jag-2配體和Dll-1配體主要參與毛細(xì)胞的體外分化的過(guò)程,并對(duì)毛細(xì)胞的分化和發(fā)育起著一定的抑制作用。當(dāng)Jag-2配體和Dll-1配體單獨(dú)受到干擾時(shí),對(duì)毛細(xì)胞體外分化的影響不顯著,而當(dāng)兩者同時(shí)受到干擾時(shí),較為明顯地促進(jìn)毛細(xì)胞的體外分化,且抑制了支持細(xì)胞的分化。因此,我們認(rèn)為Jag-2配體和Dll-1配體可能是協(xié)同作用的。本章研究主要是為進(jìn)一步研究毛細(xì)胞的體外誘導(dǎo)體系中Notch信號(hào)通路的作用機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:In recent years , it is necessary to establish a simple and efficient system for the induction and differentiation of human embryonic stem cells into inner ear progenitor cells . In order to avoid the interference of stromal cells , we used laminin as a matrix to replace chicken embryo oval cell matrix cells .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R764

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本文編號(hào)：1441552