本文關(guān)鍵詞：IL-10基因修飾的樹突狀細胞在大鼠角膜移植中的作用　出處：《遼寧醫(yī)學(xué)院》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的1.培養(yǎng)大鼠骨髓源樹突狀細胞，研究應(yīng)用腺病毒轉(zhuǎn)染IL-10基因后樹突狀細胞的表型及功能變化。2.建立同種異體大鼠角膜穿透性移植模型，探討IL-10基因修飾的未成熟樹突狀細胞在大鼠角膜移植排斥反應(yīng)中的作用。 方法1.通過利用大鼠淋巴細胞分離液及細胞因子誘生方法，提取大鼠骨髓源樹突狀細胞的前體細胞并進行培養(yǎng)。培養(yǎng)至第6天時將培養(yǎng)的細胞分為3組：第1組原條件繼續(xù)培養(yǎng)至第12天，即12-DC組；第2組轉(zhuǎn)染滴度為107的GFP-Adenovirus，繼續(xù)培養(yǎng)至第12天，即GFP-DC組；第3組轉(zhuǎn)染滴度為107的IL-10-GFP-Adenovirus，繼續(xù)培養(yǎng)至第12天，即IL-10-GFP-DC組。利用流式細胞儀（FCM）檢測3組樹突狀細胞特異性成熟標(biāo)志CD83以及細胞表面共刺激分子CD86的表達；利用MTT方法比較3組樹突狀細胞刺激同種異體T淋巴細胞增殖的能力；利用臺盼蘭檢測方法，檢測細胞活性；利用Western Blot方法，檢測IL-10蛋白的表達。2.將受體SD大鼠隨機分為4組：陽性對照組、GFP-DC組、8-DC組及IL-10-GFP-DC組，分別于角膜移植術(shù)前3天尾靜脈注射等量的PBS、供體Wistar大鼠骨髓源8-DC（培養(yǎng)8天的DC）、轉(zhuǎn)染48h的GFP-DC及IL-10-GFP-DC，建立大鼠穿透性角膜移植模型。術(shù)后每天在裂隙燈下對角膜植片進行臨床觀察，記錄排斥反應(yīng)指數(shù)及角膜植片存活時間。大鼠角膜移植術(shù)后第14天行各組角膜組織的病理學(xué)檢查及免疫組織化學(xué)檢查。 結(jié)果1.新提取的樹突狀細胞前體細胞呈圓形，細胞小，形狀規(guī)則；培養(yǎng)到第2天時細胞體積開始增大，并呈現(xiàn)出集落生長；培養(yǎng)至第4天時，細胞體積繼續(xù)增大，細胞集落也增大，很多細胞開始出現(xiàn)大小不規(guī)則、形狀不一的突起；第6天，細胞體積進一步增大，細胞突起更為明顯。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞形態(tài)變化更加明顯，并開始呈現(xiàn)樹突狀細胞形態(tài)；第12天可見細胞不規(guī)則，細胞表面出現(xiàn)粗細不等、長短不一的樹枝狀或毛刺狀突起，呈現(xiàn)典型的樹突狀細胞的形態(tài)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示： IL-10-GFP-DC表面分子CD83，CD86表達為約16%，20%，較GFP-DC組（44%，42%）及12-DC組（45%，48%）表達水平低。MTT結(jié)果顯示：IL-10-GFP-DC刺激同種異體T細胞增殖能力最弱，12-DC刺激同種異體T細胞增殖能力最強，差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01）。臺盼蘭染色檢測，顯示細胞活性98%。Western Blot檢測，觀察到IL-10-GFP-DC組出現(xiàn)IL-10蛋白特征性條帶表達。2.陽性對照組、GFP-DC組、8-DC組及IL-10-GFP-DC組角膜植片的存活時間分別為：10.29±1.11d、19.14±1.34d、18.57±1.27d、25.86±1.07d，GFP-DC組、8-DC組、IL-10-GFP-DC組與陽性對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01）；IL-10-GFP-DC組角膜植片存活時間較GFP-DC組、8-DC組比較顯著延長（P0.01）；GFP-DC組與8-DC組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。術(shù)后第14天陽性對照組、GFP-DC組、8-DC組以及IL-10-GFP-DC組的排斥反應(yīng)指數(shù)分別為：6.71±0.49、3.71±0.49、3.86±0.38、1.71±0.49，GFP-DC組、8-DC組、IL-10-GFP-DC組與陽性對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01）；IL-10-GFP-DC組與8-DC組、GFP-DC組相比較，有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01）；GFP-DC組與8-DC組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，陽性對照組角膜植片明顯增厚，基質(zhì)層結(jié)構(gòu)紊亂，植片中可見大量炎細胞浸潤，并可見新生血管；GFP-DC組、8-DC組、IL-10-GFP-DC組角膜植片的炎癥反應(yīng)較陽性對照組輕，植片中央未見明顯新生血管。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：IL-10-GFP-DC組的CD4~+、CD8~+、CD25~+、IL-2~+、NK~+及NF-κB~+陽性細胞數(shù)量較陽性對照組、GFP-DC組、8-DC組減少，陽性對照組角膜植片中CD4~+、CD8~+、CD25~+、IL-2~+、NK~+及NF-κB~+陽性細胞數(shù)量最多。 結(jié)論1.應(yīng)用細胞因子誘生方法，成功培養(yǎng)出大鼠骨髓源樹突狀細胞。轉(zhuǎn)染IL-10基因后的樹突狀細胞分泌IL-10細胞因子，大鼠骨髓源樹突狀細胞表面成熟特異性標(biāo)志CD83及共刺激分子CD86的表達水平最低，，刺激T細胞增殖的能力弱，抑制樹突狀細胞的成熟。2.經(jīng)過供體來源樹未成熟突狀細胞預(yù)處理的受體，角膜植片的存活時間顯著延長，成功誘導(dǎo)角膜移植免疫耐受。CD4~+、CD8~+、CD25~+、IL-2~+、NK~+及NF-κB~+陽性細胞參與了同種異體角膜移植排斥反應(yīng)的調(diào)控，IL-10-GFP-DC可降低CD4~+、CD8~+、CD25~+、IL-2~+、NK~+及NF-κB~+陽性細胞的浸潤，抑制角膜移植排斥反應(yīng)的發(fā)生。
[Abstract]:The purpose of the 1. cultured rat bone marrow-derived dendritic cells, research and application of adenovirus transfected IL-10 gene changes of.2. phenotype and function of dendritic cells in allogeneic rat corneal penetrating transplantation model of IL-10 gene modified immature dendritic cells in rat corneal allograft rejection in rats.
Methods 1. by induced by rat lymphocyte separation medium and cytokines, extraction of progenitor cells from rat bone marrow derived dendritic cells were cultured and cultured for sixth days culture. The cells were divided into 3 groups: the first groups of the original conditions up to the twelfth day, 12-DC group; second group transfection titer 107 GFP-Adenovirus, up to the twelfth day, GFP-DC group; third group transfection titer was 107 IL-10-GFP-Adenovirus, up to the twelfth day, IL-10-GFP-DC group. Using flow cytometry (FCM) detection of 3 groups of dendritic cell specific markers of cell surface expression of CD83 and costimulatory molecules CD86; using MTT method comparison of 3 groups of dendritic cells stimulate proliferation of allogeneic T lymphocytes; using trypan blue detection method, detection of cell activity; using Western Blot method to detect the expression of.2. IL-10 protein by SD Rats were randomly divided into 4 groups: positive control group, GFP-DC group, 8-DC group and IL-10-GFP-DC group, respectively, on the 3 day tail vein injected PBS before corneal transplantation, donor Wistar rat bone marrow derived 8-DC (cultured with DC for 8 days), GFP-DC and IL-10-GFP-DC transfected with 48h, the establishment of penetrating corneal transplantation model every day after operation. The rats under slit lamp of corneal graft were observed and recorded the rejection index and corneal graft survival time. Immunohistochemical examination and pathological examination of rat corneal transplantation after fourteenth days were corneal tissue.
Results 1. new extracted dendritic cell precursor cells were round, small cell, regular shape; up to second days when the cell volume began to increase, and showed colony growth; after fourth days of culture, the cell volume increases, cell colony is also increasing, many cells began to appear irregular size, shape a process; Sixth days, cell volume increased, the more obvious cellularprocesses. With prolonged incubation time, the more obvious changes in cell morphology, and began to show the morphology of dendritic cells; twelfth days cells showed irregular, cell surface thickness ranging from different lengths of dendritic or burr like protrusions, typical dendritic cell morphology. Flow cytometry results showed that: the surface molecules of IL-10-GFP-DC CD83, the expression of CD86 was about 16%, 20%, compared with the GFP-DC group (44%, 42%) and 12-DC group (45%, 48%).MTT showed low levels of expression The weakest: IL-10-GFP-DC stimulation of allogeneic T cells proliferation, 12-DC to stimulate allogeneic T cell proliferation ability was the strongest, the difference was statistically significant (P0.01). Trypan blue staining showed that the cell activity of 98%.Western detection, Blot detection, were observed in the IL-10-GFP-DC group the IL-10 protein expression of.2. characteristic bands of the positive control group, GFP-DC group, 8-DC group and IL-10-GFP-DC group of corneal graft survival time was 10.29 + 1.11d, 19.14 + 1.34d, 18.57 + 1.27d, 25.86 + 1.07d, GFP-DC group, 8-DC group, IL-10-GFP-DC group and positive control group with significant difference (P0.01); group IL-10-GFP-DC, corneal graft survival time compared with GFP-DC group, 8-DC group significantly increased (P0.01); GFP-DC group and 8-DC group had no statistical significance (P0.05). After fourteenth days of positive control group, GFP-DC group, 8-DC group and IL-10-GFP-DC group respectively the rejection index : 6.71 + 0.49,3.71 + 0.49,3.86 + 0.38,1.71 + 0.49, GFP-DC group, 8-DC group, IL-10-GFP-DC group compared with the positive control group, the difference was statistically significant (P0.01); IL-10-GFP-DC group and 8-DC group, GFP-DC group compared with statistical significance (P0.01); GFP-DC group compared with 8-DC group, the difference was not statistically significant (P0.05). Histopathological examination showed that the positive control group of corneal stromal layer thickening, structural disorder, the graft showed large amounts of inflammatory cell infiltration, neovascularization and visible; GFP-DC group, 8-DC group, IL-10-GFP-DC group, inflammatory reaction corneal graft compared with the positive control group, the grafts had no obvious neovascularization. The immunohistochemistry results showed that: IL-10-GFP-DC group of CD4~+, CD8~+, CD25~+, IL-2~+, NK~+ and NF- K B~+ the number of positive cells compared with the positive control group, GFP-DC group, 8-DC group, positive control group corneal graft in CD4~+, CD8~+, CD The number of 25~+, IL-2~+, NK~+ and NF- kappa B~+ positive cells was the most.
Conclusion the application of 1. cytokines inducedmethod, successfully cultured rat bone marrow derived dendritic cells. The secretion of IL-10 cytokines after IL-10 gene transfection of dendritic cells derived from rat bone marrow dendritic cells maturation specific marker expression of CD83 and costimulatory molecule CD86 is the lowest, the ability to stimulate the proliferation of T cells is weak, inhibition of dendritic cells the mature.2. after donor derived immature dendritic tree cell pretreatment receptors, survival time of corneal grafts was prolonged and successfully induced corneal transplantation immune tolerance of.CD4~+, CD8~+, CD25~+, IL-2~+, NK~+ and NF- K B~+ positive cells participate in the regulation of corneal allograft rejection, IL-10-GFP-DC can reduce CD4~+, CD8~+. CD25~+, IL-2~+, NK~+ and NF- K infiltration of B~+ positive cells, inhibit the occurrence of corneal allograft rejection.

【學(xué)位授予單位】：遼寧醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R779.65

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