發(fā)布時間：2018-01-14 01:27

  本文關鍵詞：間歇性低氧微環(huán)境下自噬調控頦舌肌肌衛(wèi)星細胞功能及其相關機制的研究　出處：《第四軍醫(yī)大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(Obstructive sleep apnea hyponea syndrome,OSAHS)是一種普遍的睡眠相關呼吸疾病,主要表現為睡眠期間上呼吸道的反復性阻塞和機體通氣障礙。作為OSAHS患者最具代表性的病理學體征,間歇性低氧(Intermittent hypoxia,IH)常引發(fā)低氧血癥,高碳酸血癥等一系列不良后果,是機體代謝性障礙及心血管疾病的潛在高危因素。有研究證實,上呼吸道擴張肌,尤其是頦舌肌功能異常是OSAHS的重要致病誘因,而IH又進一步加重了頦舌肌功能損傷。眾所周知,肌衛(wèi)星細胞(Muscle satellite cells,Mu SCs)是參與骨骼肌損傷修復的主力。然而,長期患有OSAHS的人群卻仍難以逆轉頦舌肌纖維類型改變及功能異常的情況。因此,我們推測,是否IH對頦舌肌肌衛(wèi)星細胞產生了異常影響,從而降低了其修復能力。另一方面,作為目前醫(yī)學研究領域的熱點,自噬與眾多涉及低氧的疾病緊密相關。低氧可誘發(fā)自噬。自噬通常被認為是細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要調節(jié)機制。那么自噬與IH導致的頦舌肌功能異常之間是否存在某種相關性呢?為了弄清這一問題,我們試圖通過研究IH環(huán)境下頦舌肌Mu SCs的自噬活性變化以及自噬對頦舌肌Mu SCs相關功能的影響,從而為深入探索OSAHS發(fā)病機制并研發(fā)針對頦舌肌功能異常的治療方法提供新的思路。方法1.應用改良式間歇性低氧艙建立間歇性低氧大鼠模型,并通過血氣分析法評估建模成效。2.通過透射電鏡、HE染色、免疫組織化學染色以及免疫組織熒光染色等方法觀察IH環(huán)境下頦舌肌的組織病理學變化。3.采用酶消化法與差速貼壁純化法進行大鼠頦舌肌Mu SCs原代培養(yǎng);通過MTT比色法測定細胞生長曲線;利用免疫熒光染色法鑒定細胞種屬。4.分別通過成肌、成脂、成骨誘導法檢驗頦舌肌Mu SCs的多向分化潛能。5.采用三氣培養(yǎng)箱模擬IH環(huán)境,建立頦舌肌Mu SCs間歇性低氧模型,通過蛋白質印跡法檢測不同IH時間下頦舌肌Mu SCs中自噬與凋亡相關蛋白的表達情況,初步探討IH環(huán)境下自噬與凋亡的相關性。從中選出自噬活性峰值時間點,并以此作為后續(xù)實驗默認IH處理時間。6.采用MTT比色法、蛋白質印跡法以及吖啶橙染色法共同篩選自噬抑制劑氯喹的適宜用藥濃度,并以此作為后續(xù)實驗默認用藥劑量,從而在IH環(huán)境下建立具有不同自噬活性的頦舌肌Mu SCs模型。7.通過蛋白質印跡法與流式細胞術分別檢測不同自噬活性下頦舌肌Mu SCs中凋亡相關蛋白的表達情況及細胞凋亡率。8.通過透射電鏡觀察不同自噬活性下頦舌肌Mu SCs中線粒體超微結構;采用流式細胞術檢測線粒體膜電位。9.使用激光共聚焦顯微鏡動態(tài)監(jiān)測不同自噬活性下頦舌肌Mu SCs的鈣離子水平。結果1.血氣分析結果顯示,IH組大鼠的血氧飽和度和血氧分壓較對照組明顯下降,提示間歇性低氧大鼠模型建立成功。2.HE染色結果顯示,與對照組相比,IH組大鼠頦舌肌纖維明顯肥大,形態(tài)改變,肌纖維間距狹窄。透射電鏡觀察結果顯示,與對照組相比,IH組大鼠頦舌肌中線粒體明顯腫脹,邊界不清,結構異常。免疫組化結果顯示,與對照組相比,IH組大鼠頦舌肌中細胞色素c表達顯著增加。免疫組織熒光染色結果顯示,與對照組相比,IH組大鼠頦舌肌中LC3熒光表達明顯上調。3.免疫熒光結果顯示:Pax 7蛋白染色陽性,且陽染率達95%以上,說明該細胞符合實驗要求,可用于后續(xù)研究。4.經多向分化誘導后的細胞鑒定結果顯示,頦舌肌Mu SCs能夠分化形成肌管、脂滴以及骨性礦化結節(jié)。5.蛋白質印跡實驗結果顯示,與對照組相比,IH環(huán)境下的頦舌肌Mu SCs自噬蛋白表達量普遍增加,在6h左右達到峰值,12h左右下降;同時,凋亡蛋白表達量也明顯增加,但在1、3、6h之間的蛋白表達量差異不明顯,隨著時間推移,其在12、24h的表達量顯著遞增。依實驗所需,后續(xù)實驗以自噬活性峰值點6h作為默認IH時間。6.經MTT比色法、蛋白質印跡法及吖啶橙染色法共同篩選得出,自噬抑制劑氯喹的適宜用藥濃度為25μmol/L,且在該濃度下氯喹能夠有效抑制IH誘發(fā)的自噬。7.蛋白質印跡實驗結果顯示,與對照組相比,IH組Cyt c、caspase 3蛋白表達明顯增加;與IH組相比,IH+氯喹組Cyt c、caspase 3蛋白表達顯著提高。流式細胞術結果顯示,細胞凋亡率依次為:IH+氯喹組IH組對照組。各組差異有統(tǒng)計學意義。8.透射電鏡觀察結果顯示:對照組線粒體未見明顯異常。IH組線粒體肥大腫脹。IH+氯喹組中線粒體皺縮。流式細胞術結果顯示,線粒體膜電位高低依次為:對照組IH組IH+氯喹組,各組間差異有統(tǒng)計學意義。9.激光共聚焦動態(tài)觀測結果顯示,細胞內鈣離子基礎熒光強度依次為:IH+氯喹組IH組對照組,差異有統(tǒng)計學意義。加入KCL刺激后,對照組細胞鈣瞬變迅速;與對照組相比,IH組細胞鈣瞬變速率降低;與IH組相比,IH+氯喹組細胞鈣瞬變遲鈍,隨后突發(fā)熒光異常淬滅。各組間差異有統(tǒng)計學意義。結論1.成功建立間歇性低氧大鼠模型。2.IH能夠引起頦舌肌組織損傷,同時觸發(fā)自噬。3.成功建立了頦舌肌Mu SCs的體外研究模型,且細胞純度高。4.IH能夠誘發(fā)頦舌肌Mu SCs的自噬與凋亡。5.適量氯喹能夠有效抑制IH環(huán)境下頦舌肌Mu SCs的自噬活性。6.在IH環(huán)境下抑制自噬活性會增加頦舌肌Mu SCs凋亡率,提示自噬可能具有抑制細胞凋亡,應對IH損傷的保護性機制。7.在IH環(huán)境下抑制自噬活性會引起頦舌肌Mu SCs線粒體及細胞功能損傷,提示自噬可能通過影響線粒體功能從而保護細胞以抵御損傷,減少凋亡。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R766

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本文編號：1421447