本文關(guān)鍵詞：MicroRNA-30b影響大鼠RGCs極性的機(jī)制及在糖氧剝奪損傷中的保護(hù)作用　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景和意義視神經(jīng)損傷是臨床治療的難點(diǎn),探討其損傷后修復(fù)相關(guān)問題對(duì)于視功能恢復(fù)和中樞神經(jīng)疾病的治療都有非常重要的意義。以往研究聚焦于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突再生,并以此來提高損傷修復(fù),但未取得滿意結(jié)果。近年來研究發(fā)現(xiàn)促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGCs)軸突生長的同時(shí),出現(xiàn)了再生纖維投射紊亂,妨礙視覺功能恢復(fù)的新問題。有研究認(rèn)為神經(jīng)元極性紊亂在其中起到了重要作用,因?yàn)樯窠?jīng)元極性決定了突觸生長方向。而RGCs突觸生長方向?qū)ζ鋼p傷修復(fù)過程中指導(dǎo)再生纖維投射有重要意義,因此恢復(fù)RGCs極性將是促進(jìn)視神經(jīng)修復(fù)的新途徑。miRNA是調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育的重要因素之一,參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控,可能參與控制神經(jīng)元極性。我們前期研究發(fā)現(xiàn),miR-30b在視神經(jīng)損傷早期表達(dá)迅速升高,在原代培養(yǎng)RGCs中促進(jìn)其軸突生長,但具體作用機(jī)制還不清楚。Sema3A具有指導(dǎo)神經(jīng)元突起生長的作用,且最近研究發(fā)現(xiàn)Sema3A參與調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元極性,并且通過影響神經(jīng)元內(nèi)c GMP/c AMP含量決定神經(jīng)突起成為軸突或者樹突,這提示Sema3A可以調(diào)節(jié)RGCs極性。而且我們前期研究發(fā)現(xiàn)miR-30b對(duì)Sema3A表達(dá)具有抑制效應(yīng)。因此我們推測miR-30b通過抑制Sema3A調(diào)節(jié)RGCs極性。此外,視神經(jīng)損傷后繼發(fā)性缺血缺氧是造成RGCs不可逆損失、影響再生修復(fù)的重要因素之一,目前認(rèn)為氧剝奪損傷機(jī)制在其中發(fā)揮重要作用。近年的研究表明,Micro RNAs(miRNAs)參與機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié),包括機(jī)體組織對(duì)缺氧的應(yīng)答反應(yīng)。尤其miR-30b可以幫助視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激損傷。那么miR-30b是否對(duì)糖氧剝奪導(dǎo)致的RGCs損傷發(fā)揮保護(hù)作用呢?尚需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究擬通過重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)RGCs調(diào)節(jié)miR-30b含量,明確miR-30b通過抑制Sema3A表達(dá)影響RGCs極性;其次,明確miR-30b在糖氧剝奪損傷中對(duì)RGCs的保護(hù)作用。為miR-30b在中樞神經(jīng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用提供了新的思路和理論依據(jù)。7方法:1、利用體外培養(yǎng)的原代RGCs,分別轉(zhuǎn)染r AAV-miR-30b mimic、r AAV-miR-30b inhibitor和r AAV-miR nc,培養(yǎng)7d后免疫組化雙熒光染色標(biāo)記(Tubulin-Ⅲ/MAP2)區(qū)分RGCs軸突和樹突。熒光顯微鏡拍照記錄,利用IPP圖像分析軟件計(jì)數(shù)軸突/樹突長度,結(jié)合統(tǒng)計(jì)軟件分析miR-30b對(duì)RGCs極性的影響。2、利用體外培養(yǎng)的原代RGCs,分別轉(zhuǎn)染r AAV-miR-30b mimic、r AAV-miR-30b inhibitor、r AAV-miR nc,以及結(jié)合應(yīng)用Si RNA-Sema3A及Sema3A高濃度組,檢測Sema3A下游信號(hào)因子。3、將原代培養(yǎng)的細(xì)胞采用r AAV-miR nc、r AAV-miR-30b mimic和r AAV-miR-30b inhibitor處理,培養(yǎng)細(xì)胞6 d。各組細(xì)胞分別進(jìn)行低氧培養(yǎng)箱(37℃,體積分?jǐn)?shù)5%CO2、17%N2、3%O2)聯(lián)合低糖(糖濃度為1.0g/L)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)以建立原代糖氧剝奪RGCs模型,并與正常培養(yǎng)(37℃、5%CO2)的細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)法檢測各組細(xì)胞活力,采用免疫熒光染色法檢測各組細(xì)胞中神經(jīng)元特異性標(biāo)志物TubulinⅢ的表達(dá),并計(jì)算存活RGCs數(shù)目。采用Hoechst/PI染色法檢測各組細(xì)胞的凋亡和壞死情況。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論:1、上調(diào)miR-30b可顯著增加原代培養(yǎng)RGCs軸突長度,顯著減少樹突個(gè)數(shù);從而提高RGCs雙極性率。反之下調(diào)miR-30b對(duì)RGCs軸突長度沒有顯著影響,樹突個(gè)數(shù)沒有顯著改變。2、在原代培養(yǎng)RGCs中,上調(diào)miR-30b可顯著降低Sema3A蛋白表達(dá)。而干擾Sema3A表達(dá)后,Sema3A含量也顯著降低。反而下調(diào)miR-30b表達(dá)量對(duì)Sema3A沒有影響。上調(diào)miR-30b可顯著增加PKA活性,降低CRMP-2(T514)含量;同時(shí)在原提高Sema3A濃度可顯著降低PKA活性,增加CRMP-2(T514)含量。3、在經(jīng)過糖氧剝奪處理后的原代培養(yǎng)RGCs中,上調(diào)miR-30b含量可見TubulinⅢ陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多,細(xì)胞活性明顯增強(qiáng),以及細(xì)胞凋亡率和死亡率明顯降低。但下調(diào)miR-30b含量對(duì)TubulinⅢ陽性細(xì)胞數(shù)量沒有明顯改變。上述研究結(jié)果提示:在體外培養(yǎng)的原代RGCs中miR-30b水平升高,可以促進(jìn)軸突生長,抑制樹突生長,有助于維持RGCs雙極性特性。這一作用主要通過抑制Sema3A表達(dá),進(jìn)一步增強(qiáng)PKA活性,降低CRMP-2磷酸化程度來實(shí)現(xiàn)的。此外,糖氧剝奪損傷是造成視神經(jīng)損傷不可逆再生的重要原因,而miR-30b對(duì)糖氧剝奪損傷后RGCs活性具有保護(hù)作用。因此,我們認(rèn)為miR-30b的上述特性在促進(jìn)視神經(jīng)損傷修復(fù)過程中具有重要的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R774.6

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