發(fā)布時間：2017-12-18 17:15

  本文關(guān)鍵詞：人胚胎干細胞誘導分化為視網(wǎng)膜感光前體細胞的實驗研究

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【摘要】：目的：1.觀察hESC向視網(wǎng)膜感光前體細胞分化過程中的形態(tài)學變化,通過比較不同的培養(yǎng)方法探討最優(yōu)的分化培養(yǎng)策略。2.檢測hESC向視網(wǎng)膜感光前體細胞分化過程中Ki67、SSEA4、Otx2、Sox2、 Rhodopsion等基因在不同培養(yǎng)時期的表達規(guī)律。方法：1.采用貼壁培養(yǎng)加懸浮培養(yǎng)的方式誘導hESC H1細胞系向視網(wǎng)膜前體細胞分化,并通過免疫熒光染色的方法觀察hESC定向誘導分化為視網(wǎng)膜感光前體細胞培養(yǎng)第0、第10、第20、第30天不同時間點細胞形態(tài)和增殖周期的特性;2.通過Western Blot、qRT-PCR等方法檢測hESC定向誘導分化為視網(wǎng)膜感光前體細胞培養(yǎng)第0、第10、第20、第30天不同時間點基因表達水平和相應蛋白的變化。結(jié)果：1.H1細胞在Matrigel膠上6小時左右即可貼壁,貼壁后細胞由圓形逐漸伸出偽足向四周延展,胞體呈長梭形,光鏡下胞體透亮,折光性較強,核分裂像明顯,細胞生長2-3天后相鄰細胞集落逐漸融合,細胞呈網(wǎng)狀聚集,細胞融合度在培養(yǎng)2-3天時可達80-90%左右。2.H1細胞在擬胚體培養(yǎng)基中生長1天后散在的細胞即可聚集成球狀細胞團,根據(jù)細胞數(shù)目不同細胞團的直徑也不盡相同,隨著培養(yǎng)時間的延長細胞團直徑略有增長,在光鏡下觀察可見擬胚體細胞團中間稍暗周邊透亮,細胞失去貼壁時的長梭行態(tài)并互相緊密貼合在擬胚體細胞團塊內(nèi)。3.擬胚體在視網(wǎng)膜感光前體細胞分化培養(yǎng)基中第一天即可貼附于孔底,細胞團中間密度較大細胞緊密排列,周圍密度較小可見細胞爬出,隨著培養(yǎng)時間的延長,細胞團周圍逐漸有類圓形細胞爬出,初始時細胞體積較小,排列擁擠,在向四周延展的同時,細胞逐漸變大,細胞形態(tài)由原來的類圓形變?yōu)殚L梭形,在第10天左右形成玫瑰花結(jié)形狀,細胞形態(tài)隨著時間的延長細胞軸突逐漸增多伸長,與神經(jīng)細胞類似。4.細胞免疫熒光、Western Blot、qRT-PCR等方法結(jié)果顯示hESC定向誘導分化為視網(wǎng)膜感光前體細胞過程中,第0、10、20、30天時Otx2和S0x2二者始終陽性表達;SSEA4表達量隨培養(yǎng)時間的延長減少;Ki67表達量逐漸減少;Rhodopsin始終不表達。結(jié)論：改良SFEB/DLFA分化方法,即在擬胚體培養(yǎng)和視網(wǎng)膜感光前體細胞分化培養(yǎng)基中分別添加B-27、Noggin、Dkk-1以及IGF-1等細胞因子可使胚胎干細胞在自身基因調(diào)控與分化培養(yǎng)基共同作用下,在無血清無feeder條件下高效向視網(wǎng)膜感光前體細胞分化。視網(wǎng)膜感光前體細胞分化培養(yǎng)過程中細胞的分裂增殖能力逐漸降低,D30時仍然具有部分干細胞分化增殖能力,SSEA-4表達量減少,表示細胞逐漸分化成熟,Otx2基因與Sox2基因作為眼發(fā)育過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子、視網(wǎng)膜祖細胞的重要標記物在視網(wǎng)膜感光前體細胞分化中高表達,但尚未發(fā)育為成熟的視網(wǎng)膜光感受器細胞。
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R774.1
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本文編號：1304978