本文關(guān)鍵詞：基于羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽納米載體的miR96內(nèi)耳遞送初步研究

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【摘要】：背景感音神經(jīng)性耳聾是由于耳蝸毛細(xì)胞、聽神經(jīng)或聽覺中樞病變,對聲音的感受或神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)發(fā)生障礙引起的聽力下降。大部分感音神經(jīng)性耳聾是由耳蝸感覺神經(jīng)上皮毛細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或功能異常引起的,而哺乳動物損傷的毛細(xì)胞不可自主再生。最根本的治療方法是通過干預(yù)促進(jìn)異常毛細(xì)胞修復(fù)或死亡毛細(xì)胞再生。隨著基因技術(shù)的發(fā)展,研究者發(fā)現(xiàn)約30424個成熟miRNA參與幾乎所有細(xì)胞的增殖、分化、生長發(fā)育過程,多種miRNA在小鼠耳蝸中高表達(dá)，其中miRNA 183家族被證實(shí)與耳蝸毛細(xì)胞的分化、發(fā)育及人類聽力損失密切相關(guān)。RNA干擾主要是通過miRNA實(shí)現(xiàn)特定基因沉默。選擇合適的載體將1miRNA遞送至內(nèi)耳是實(shí)現(xiàn)RNA干擾的關(guān)鍵。病毒載體和非病毒載體是目前常用的miRNA載體,病毒載體有誘發(fā)免疫反應(yīng)、潛在致癌等風(fēng)險,使其在體應(yīng)用中受限。近年來,非病毒載體逐漸成為研究熱點(diǎn),其中,納米載體以其無免疫原性、可生物降解性及生物相容性等優(yōu)勢,成為較理想的miRNA載體。陽離子脂質(zhì)體(Lipo)由于其高轉(zhuǎn)染率是目前最常用的非病毒性miRNA載體,但由于其自身帶有正電荷,細(xì)胞毒性較大,并且無靶向性和緩釋特性,因此無法實(shí)現(xiàn)應(yīng)用于臨床。羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽納米裁體(CTNs),是由羧甲基化的殼聚糖與TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽通過自組裝方式合成的納米顆粒。羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl chitosan,CMC)有良好的生物相容性及幾乎無毒性,產(chǎn)物無毒、可被生物體吸收,且可溶于水,是一種具有PH感應(yīng)性的兩性聚合材料。TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽是人類免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus-1,HIV-1)編碼的帶正電荷多膚,可以通過共價結(jié)合或靜電作用高效穩(wěn)定的結(jié)合核酸,其短肽有破膜作用,能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)不同的外源生物大分子通過生物膜和生理屏障,達(dá)到高轉(zhuǎn)染率。CTNs不但有高效轉(zhuǎn)染的特性,而且在酸性環(huán)境中,表面負(fù)電荷轉(zhuǎn)變?yōu)檎姾?提高內(nèi)含體逃逸能力,達(dá)到高效轉(zhuǎn)染、靶向緩釋的目的。目前脂質(zhì)體是內(nèi)耳遞送miRNA最常用的非病毒載體,盡管CTNs已成功用于miRNA轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞,并能夠?qū)崿F(xiàn)相應(yīng)的功能調(diào)控,但其用于內(nèi)耳遞送1miRNA研究未見報道。目的構(gòu)建用于內(nèi)耳遞送miRNA的非病毒納米載體,以陽離子脂質(zhì)體作為對照,初步探究羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽納米載體(CTNs)介導(dǎo)miR96轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和耳蝸基底膜的效率及安全性,為miR96在內(nèi)耳的功能研究奠定基礎(chǔ)。方法1.通過Lipo與cy3標(biāo)記的miR96混合制得Lipo-miR96-cy3復(fù)合物,設(shè)濃度為30nM,50nM,100nM的Lipo-miR96-cy3復(fù)合物轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和耳蝸基底膜,并設(shè)空白和miRNA96-cy3為對照組,激光共聚焦顯微鏡下觀察cy3紅色熒光分布情況、細(xì)胞特異性。2.CMC和TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽按1.5mg/1mg(1.5:1)質(zhì)量比制備獲得的CTNs,包封miR96-cy3制備羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-miR96-cy3 (M-CTNs)復(fù)合物。3.用150nM Lipo-miR96-cy3復(fù)合物和M-CTNs復(fù)合物分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和耳蝸基底膜8小時,并設(shè)空白對照組,以Lipo-miR96-cy3復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率為對照評估M-CTNs復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效果及細(xì)胞特異性,MTT測定比較兩種載體的細(xì)胞毒性。結(jié)果1.Lipo-miRNA96-cy3復(fù)合物與293細(xì)胞共同作用8小時后,被成功攝取,并且隨Lipo-miRNA96-cy3復(fù)合物轉(zhuǎn)染濃度的增大,cy3紅色熒光陽性細(xì)胞數(shù)增多,50nM組熒光陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于30nM組(t=-10.801, P=0.000), 100nM組熒光陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于50nM組(t=11.754,P=0.000),并且單個細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增強(qiáng),對照組未見熒光。Lipo-miRNA96-cy3復(fù)合物與耳蝸基底膜共同作用8小時后,內(nèi)外毛細(xì)胞、支持細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)均可見紅色熒光,并隨濃度增大而增強(qiáng),無明顯細(xì)胞特異性。2.本部分實(shí)驗(yàn)成功制備了CTNs,納米顆粒平均直徑約186.6nm,粒徑分布集中,無明顯團(tuán)聚現(xiàn)象。M-CTNs復(fù)合物包封率達(dá)90%以上,對PH5.5的酸性環(huán)境反應(yīng)靈敏，zeta電位在1小時內(nèi)由-30.9mV快速升至20mV,具備將負(fù)電荷轉(zhuǎn)變?yōu)檎姾傻馁|(zhì)子化特性,為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。3. Lipo-miR96-cy3復(fù)合物和M-CTNs復(fù)合物分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和耳蝸基底膜，均表現(xiàn)為Lipo組熒光較M-CTNs組強(qiáng)，但Lipo組熒光呈聚集點(diǎn)狀分布,而M-CTNs組熒光呈均勻分布，MTT實(shí)驗(yàn)測定M-CTNs組OD值高于Lipo組(t=-4.436,P=0.013)。結(jié)論陽離子脂質(zhì)體(Lipo)介導(dǎo)的miR96的體外轉(zhuǎn)染效率高,但其細(xì)胞毒性較大,體內(nèi)應(yīng)用受限,羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-miR96-cy3 (M-CTNs)復(fù)合物細(xì)胞毒性小,內(nèi)含體逃逸能力高,其介導(dǎo)的miR96的體外轉(zhuǎn)染效率較陽離子脂質(zhì)體低,使用其進(jìn)行miR96的體內(nèi)外轉(zhuǎn)導(dǎo),仍需進(jìn)一步優(yōu)化。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R764.43
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本文編號：1235761