本文關(guān)鍵詞：一中國Avellino型角膜營養(yǎng)不良家系的分子遺傳學(xué)研究

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【摘要】：目的:在本課題中,我們對湖北省一Avellino型角膜營養(yǎng)不良家系開展了系列研究工作,分析該家系的臨床特征,擬通過對該家系進(jìn)行分子遺傳學(xué)分析,檢測該家系的致病基因以及突變位點(diǎn),明確其遺傳模式以及基因型與表型之間的關(guān)系,并對致病基因在Avellino型角膜營養(yǎng)不良中的作用及其分子機(jī)制進(jìn)行初步探索,從而為進(jìn)一步認(rèn)識該疾病及探索新的治療方法提供基礎(chǔ)。方法:1.對該家系進(jìn)行家系采集并繪制家系圖,對全部18名家系成員進(jìn)行詳細(xì)的眼科及全身臨床檢查分析,排除全身疾患和綜合征的可能性,確定臨床表型及發(fā)病特點(diǎn)。2.利用候選基因分析鑒定致病基因的突變位點(diǎn):提取該家系成員外周血DNA,選取Avellino型角膜營養(yǎng)不良相關(guān)基因TGFβI,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該基因所有17個外顯子片段,進(jìn)行Sanger測序分析,尋找該基因的突變位點(diǎn)并明確該突變是否屬于與疾病共分離的致病突變,同時分析本家系基因型與表型的關(guān)系。3.查找不同物種的同源蛋白序列,通過比對變異位點(diǎn)的氨基酸序列,分析突變位置的進(jìn)化保守性;通過生物信息學(xué)工具預(yù)測突變對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能、理化特性方面的潛在影響。4.克隆TGFβI的編碼區(qū)序列,設(shè)計(jì)相關(guān)引物并通過定點(diǎn)突變技術(shù)引入突變,構(gòu)建TGFβI基因野生型和突變型真核表達(dá)載體,并進(jìn)行功能檢測。結(jié)果:1.對家系所有成員進(jìn)行的臨床檢查確診了該家系五例Avellino型角膜營養(yǎng)不良患者,所有患者都表現(xiàn)出單純的眼部癥狀,而其余成員表型均正常,排除了綜合征的可能。并且,女性患者的表型較男性患者嚴(yán)重。2.通過篩查TGFBI基因的所有外顯子,在該基因的4號外顯子上發(fā)現(xiàn)一雜合錯義突變c.371GA,該突變導(dǎo)致了第124位的精氨酸變成了組氨酸(p.R124H)。此雜合突變在家系中與疾病共分離,5名患者都有此突變,而正常成員均沒有。此外,還發(fā)現(xiàn)5例患者分別在第8和12外顯子上均有兩個位點(diǎn)的同義單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP),分別是c.981GA(V327V)和c.1626TC(F542F),而正常成員沒有。3.通過比對包括人類在內(nèi)的六個物種TGFβI同源蛋白的序列發(fā)現(xiàn),新突變編碼的氨基酸所在位置在所有正常野生型蛋白中均一致,表明該氨基酸位點(diǎn)進(jìn)化上高度保守。并有可能在蛋白的結(jié)構(gòu)和功能中有重要的作用。4.成功構(gòu)建了野生型/突變型TGFβI真核表達(dá)載體,并成功轉(zhuǎn)染到正常人角膜上皮細(xì)胞,進(jìn)行表達(dá)水平檢測。Western Blot結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組有重組蛋白的表達(dá),而陰性對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組無TGFβI的表達(dá)。以上結(jié)果為下一步對TGFβI基因突變致Avellino型角膜營養(yǎng)不良的可能分子機(jī)制研究打下前期基礎(chǔ)。5.在一定濃度范圍內(nèi),雌激素會刺激內(nèi)源性TGFβI基因在人角膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)論:1.研究表明,該遺傳性Avellino型角膜營養(yǎng)不良家系的疾病發(fā)生與位于人5號染色體5q31上的TGFβI基因的雜合錯義突變(c.371GA)有關(guān)。2.c.371GA突變所在的密碼子編碼的氨基酸在TGFBI蛋白的進(jìn)化上高度保守,并有可能在蛋白的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著重要作用。3.該家系的分子遺傳學(xué)研究進(jìn)一步證明Avellino型角膜營養(yǎng)不良的遺傳異質(zhì)性,即同一基因的同一位點(diǎn)突變會導(dǎo)致臨床表型的明顯差異。4.無法檢測到TGFβI基因在人角膜上皮細(xì)胞的表達(dá)情況,可能其表達(dá)水平較低或不表達(dá)。5.該家系女性患者表型較重可能與雌激素有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R772.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1230319