本文關鍵詞：A2E在藍光致人RPE細胞損傷過程中對溶酶體膜通透性的影響

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【摘要】：目的:本課題擬通過建立A2E及藍光誘導RPE細胞損傷模型,探討A2E在藍光致人RPE細胞損傷過程中對溶酶體膜通透性的影響,為后續(xù)實驗提供基礎。方法:(1)采用MTT法檢測不同濃度A2E負載RPE細胞培養(yǎng)不同時間后RPE細胞活力,確立A2E負載RPE細胞的最適宜濃度;(2)利用熒光顯微鏡觀察RPE細胞分別負載濃度為0、10、25、50μM A2E后RPE細胞中熒光強度變化;(3)將細胞分為四組:對照組、單純藍光光照組、A2E負載組、A2E負載+藍光光照組。TUNEL法、流式細胞儀檢測RPE細胞凋亡情況;(4)吖啶橙(AO)標記,運用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察A2E負載后RPE細胞內(nèi)溶酶體膜通透性變化并利用共聚焦軟件對熒光強度進行分析。結果:(1)MTT比色法顯示,A2E(10μM、25μM、50μM)作用于RPE細胞12h、24h、48h、72h,細胞增殖率隨濃度增加出現(xiàn)下降趨勢。當A2E負載濃度為10μM時,細胞培養(yǎng)12h、24h、48h、72h時,與對照組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.821,0.641,0.406,0.572);當A2E負載濃度為25μM、50μM時,在細胞培養(yǎng)12h時,與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.169,0.058);當A2E負載濃度為25μM、50μM時,在24h時,OD值分別為(0.423±0.035)、(0.349±0.010),低于對照組(0.508±0.035),差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.000,0.000);當A2E負載濃度為25μM、50μM時,在48h時,OD值分別為(0.544±0.042)、(0.439±0.086),低于對照組(0.688±0.064),差異有統(tǒng)計學意義(P=0.028,0.002);當A2E負載濃度為25μM、50μM時,在72h時,OD值分別為(0.661±0.021)、(0.430±0.082),低于對照組(0.878±0.032),差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.000,0.000)。因此,我們選擇濃度為25μM的A2E負載于RPE細胞進行后續(xù)實驗研究。(2)不同濃度A2E負載RPE細胞后,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)隨著A2E的負載濃度增加,RPE細胞胞漿內(nèi)熒光強度逐漸由綠色變?yōu)辄S色。(3)流式細胞儀檢測:對照組RPE細胞凋亡率(3.39±0.15%)、A2E負載組凋亡率(4.61±1.44%)、單純藍光光照組(8.21±0.52%)、藍光+A2E負載組(24.77±1.49%)。各組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=130.292,P=0.000)。光照組、A2E負載+藍光光照組凋亡率高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.004,0.000);A2E負載組與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.348);A2E負載+光照組較光照組及A2E負載組凋亡率高,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000,0.000);光照組較A2E負載組凋亡率高,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.019)。(4)TUNEL法檢測各組細胞凋亡情況:對照組(10.40±2.46%)、A2E負載組(24.07±1.17%)、單純藍光光照組(43.00±4.41%)、A2E負載+光照組(53.00±4.50%)。各組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=92.423,P=0.000)。A2E負載組、光照組、A2E負載+藍光光照組凋亡率高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001,0.000,0.000);A2E負載+光照組較光照組及A2E負載組凋亡率高,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.007,0.000);光照組較A2E負載組凋亡率高,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。(5)光照組、A2E負載組、A2E負載+光照組與對照組比較紅色顆粒狀熒光均減弱,胞漿的綠色熒光增強。利用Leica Confocal Software(LCS Lite)進行熒光強度分析,4組平均熒光強度(紅色)分別為:對照組(37.00±1.30)、光照組(29.48±0.62)、A2E負載組(32.37±0.72)、A2E負載+光照組(22.16±0.73)。各組間整體平均熒光強度比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=246.955,P=0.000)。光照組、A2E負載組及A2E負載+光照組均低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000,0.000,0.000);光照組低于A2E負載組,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000);A2E負載+光照組低于光照組、A2E負載組,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000,0.000)。結論:(1)A2E負載RPE細胞的最適宜濃度為25μM。(2)藍光光照、A2E聯(lián)合藍光光照可導致RPE細胞凋亡,且兩者具有協(xié)同作用。(3)A2E、藍光光照、A2E聯(lián)合藍光光照可導致RPE細胞內(nèi)溶酶體膜通透性增加。
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R774

【參考文獻】

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本文編號：1209172