本文關(guān)鍵詞：間歇低氧狀態(tài)下HIF-1α介導(dǎo)海馬神經(jīng)自噬激活的機(jī)制研究

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【摘要】：目的阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)可導(dǎo)致或加重認(rèn)知功能障礙,其機(jī)制與間歇低氧(IH)所致海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。我們前期研究已證實(shí)間歇低氧可以誘導(dǎo)自噬激活并加重了海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。然而,間歇低氧是如何誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬激活并加重凋亡的,其具體機(jī)制仍不清楚。低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)是由對(duì)氧敏感的α亞基和結(jié)構(gòu)亞基β亞基組成,在低氧、缺血/再灌注等處理后其表達(dá)均明顯增加并可以介導(dǎo)細(xì)胞自噬激活。此外,HIF-1α的下游靶蛋白BNIP3與自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)也密切相關(guān)。因此,我們推測(cè)HIF-1α可能介導(dǎo)了間歇低氧致海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡中自噬的變化。本研究通過(guò)間歇低氧處理海馬神經(jīng)細(xì)胞建立OSAHS模型,應(yīng)用藥物干預(yù)HIF-1α表達(dá)及多種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù),檢測(cè)各組海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬強(qiáng)度和HIF-1α-BNIP3-Beclin1信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡的變化,研究間歇低氧是否通過(guò)HIF-1α-BNIP3-Beclin1信號(hào)通路介導(dǎo)了海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬激活并促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。方法(1)研究對(duì)象:取新生SD乳鼠(出生24h內(nèi)),剝離出海馬組織,制備細(xì)胞懸液,接種并行原代海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng),普通光學(xué)顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元的生長(zhǎng)情況。(2)模型建立與分組:建立不同時(shí)間段的間歇低氧細(xì)胞模型,設(shè)正常對(duì)照組(NC)、間歇低氧4h、8h、12h組。IH組循環(huán)給予常氧21%O2持續(xù)10min,低氧1.5%O2持續(xù)5min,分別處理4h、8h和12h,NC組持續(xù)給予21%濃度的常氧。(3)藥物干預(yù)與分組:給予YC-1干預(yù)HIF-1α表達(dá),設(shè)正常對(duì)照組、IH組、YC-1干預(yù)組、IH+YC-1干預(yù)組。選取HIF-1α及自噬表達(dá)變化最明顯的間歇低氧時(shí)間點(diǎn)12h進(jìn)行處理,YC-1預(yù)處理方法:YC-1稀釋液在間歇低氧或常氧前預(yù)處理2h。(4)檢測(cè)指標(biāo):通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞膜標(biāo)記蛋白MAP-2的表達(dá);通過(guò)western blot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)各組海馬神經(jīng)細(xì)胞LC3-II和cleaved-caspase-3以及HIF-1α-BNIP3-Beclin1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,TUNEL法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果(1)海馬神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)觀察:光學(xué)顯微鏡下觀察到成熟的海馬神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)出聚集生長(zhǎng)趨勢(shì),神經(jīng)元的軸突和樹(shù)突增粗并相互交織形成網(wǎng)狀,且免疫熒光顯示海馬神經(jīng)細(xì)胞特異性表達(dá)MAP-2。(2)間歇低氧對(duì)海馬神經(jīng)元HIF-1α和LC3-II蛋白表達(dá)的影響:western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,IH組HIF-1α和LC3-II蛋白表達(dá)均明顯增多,兩種蛋白表達(dá)均與間歇低氧時(shí)間有關(guān),間歇低氧12h表達(dá)最多,與NC組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);免疫熒光染色檢查顯示間歇低氧處理后分別代表HIF-1α、LC3-II綠色熒光增加(P0.05)(3)干預(yù)HIF-1α表達(dá)對(duì)海馬神經(jīng)元的自噬水平影響:western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與NC組相比IH組LC3-II蛋白表達(dá)顯著增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);YC-1+IH組LC3-II表達(dá)較IH組明顯減少(P0.05)。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比IH組代表LC3-II的綠色熒光點(diǎn)數(shù)顯著增多(P0.05);YC-1+IH組綠色熒光點(diǎn)數(shù)較IH組明顯減少,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(4)干預(yù)HIF-1α表達(dá)對(duì)原代海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響:western blot技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,IH組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯增多,并與間歇低氧時(shí)間有關(guān),間歇低氧12h表達(dá)最多,與NC組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);YC-1+IH組cleaved-caspase3蛋白表達(dá)較IH組明顯減少(P0.05);TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果也顯示,間歇低氧處理后細(xì)胞凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加(P0.05),YC-1+IH組細(xì)胞凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較IH組明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)干預(yù)HIF-1α表達(dá)對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞HIF-1α-BNIP3-Beclin1通路蛋白及自噬標(biāo)記蛋白LC3-II表達(dá)的影響:western blot技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,IH組HIF-1α、BNIP3、Beclin1和LC3-II蛋白表達(dá)明顯增高,且隨著間歇低氧時(shí)間的增加,蛋白表達(dá)也逐漸增多IH12h表達(dá)最多,與正常對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);YC-1+IH組HIF-1α、BNIP3、Beclin1和LC3-II蛋白表達(dá)較IH組明顯減少,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);YC-1單獨(dú)給藥組HIF-1α、BNIP3、Beclin1和LC3-II蛋白表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著差異。結(jié)論本研究證實(shí):(1)間歇低氧處理后海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬激活伴隨著HIF-1α高表達(dá);(2)間歇低氧狀態(tài)下抑制HIF-1α的表達(dá)后自噬標(biāo)記蛋白LC3-II表達(dá)也降低;(3)間歇低氧狀態(tài)下海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡蛋白cleaved-caspase3表達(dá)增加,抑制HIF-1α的表達(dá)后cleaved-caspase3蛋白表達(dá)明顯減少。(4)間歇低氧狀態(tài)下HIF-1α-BNIP3-Beclin1信號(hào)通路蛋白表達(dá)均增加,抑制HIF-1α的表達(dá)后HIF-1α-BNIP3-Beclin1信號(hào)通路蛋白表達(dá)均降低。綜上所述,間歇低氧狀態(tài)下,HIF-1α可能通過(guò)HIF-1α-BNIP3-Beclin1信號(hào)通路介導(dǎo)了自噬激活并加重了海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R766

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 王玲;張盼盼;王紅陽(yáng);禹江濤;張敏;韓曉慶;李琳;劉晨;;間歇低氧促進(jìn)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子1和存活素的表達(dá)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2015年03期

2 陳曦;梁文穎;熊靜波;;自噬的檢測(cè)方法及評(píng)述[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2012年09期

3 楊方;柳國(guó)勝;盧曉曄;康舉齡;;Caspase-3在缺氧和內(nèi)毒素致腎小管損傷的腎組織表達(dá)[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2009年10期

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本文編號(hào)：1143942