本文關鍵詞：EB病毒衣殼抗原（VCA）IgA及核抗原1（NA1）IgG時間分辨熒光免疫定量檢測試劑的研制

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【摘要】：研究背景及目的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國南方及東南亞地區(qū)較為常見的惡性腫瘤之一,好發(fā)于廣東、廣西、福建、湖南、香港、臺灣等及東南亞一些國家。鼻咽癌多侵犯35～50歲的中老年人群,占總患病人數(shù)的60%,青少年則少見。據(jù)世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)統(tǒng)計,大約80%的鼻咽癌發(fā)生在中國,嚴重危害人民的健康和生命安全,是中國重點防治的惡性腫瘤之一。2003～2007年中國鼻咽癌的發(fā)病率為4.20/10萬人,死亡率為2.24/10萬人。珠江流域發(fā)病率在10/10萬人以上。中國鼻咽癌年平均死亡率,男性為2.49/10萬人,女性為1.27/10萬人,南方5省年平均死亡率為4.35/10萬人。鼻咽癌的發(fā)生與環(huán)境、遺傳、病毒三者作用相關。鼻咽癌是第一個被發(fā)現(xiàn)與EB病毒感染有關的人類癌癥。研究證實未分化型鼻咽癌與EB病毒感染密切相關。鼻咽癌早期通常無明顯癥狀且腫瘤好發(fā)部位比較隱匿,確診往往受到延誤,因而令病人錯過治療的最佳時機。研究表明,鼻咽癌首診時的誤診率高達86.98%,因而對鼻咽癌的早期診斷是非常有必要。鼻咽癌5年生存率Ⅰ、Ⅱ期可高達60%以上,而Ⅲ、Ⅳ鼻咽癌則下降至20%-40%�？梢姳茄拾┰缙谠\斷是提高治療效果、爭取良好預后的關鍵。近年來的研究表明,與EB病毒感染相關的免疫血清學與生物學標志產(chǎn)物作為鼻咽癌早期篩查、輔助診斷、臨床分期、療效判斷和預后預測有著獨特的優(yōu)勢。EB病毒歸類為皰疹病毒科γ皰疹病毒亞科嗜淋巴病毒屬,可引起兩種不同類型的感染,即增殖性感染和非增值性感染。EB病毒感染與人類多種疾病發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。包括傳染性單核細胞增多癥和B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、NK細胞淋巴瘤等免疫細胞性疾病；鼻咽癌、胃癌等上皮細胞性疾病。VCA (viral capsid antigen)為病毒衣殼抗原。文獻報道,血清EB病毒VCA-IgA抗體可以在鼻咽癌發(fā)生前10-61個月出現(xiàn)�；颊叩腅B病毒抗體在高滴度水平波動,預示疾病進一步發(fā)展,提示其可能作為鼻咽癌早期診斷和鑒別診斷的標志物。在將來的鼻咽癌篩查計劃中,將VCA-IgA抗體陽性者作為嚴密監(jiān)測的人群,進行更密切的隨訪和嚴格的臨床檢查是十分必要的。血清中EB病毒VCA-IgA也可能作為評價鼻咽癌療效和監(jiān)測復發(fā)的觀測指標。EBNA1 (nuclear antigen 1)見于所有類型的潛伏性感染,是惟一在病毒相關腫瘤細胞中均有表達的蛋白,是病毒成功建立潛伏性感染的必要條件,它與病毒基因復制和維持病毒顆粒的穩(wěn)定性有關。EBNA1-IgG于發(fā)病后3-4周出現(xiàn),2-3月后達到高峰,然后滴度稍稍降低至較高水平并持續(xù)終生,是既往感染的標記。有研究表明,在鼻咽癌病人中抗EBNA1抗體可升高10倍。在鼻咽癌的發(fā)展中,抗EB病毒血清標志物主要起到短期風險預測作用,通過普查檢測VCA-IgA及NA1-IgG抗體水平,可提高鼻咽癌篩查的早診率,降低死亡率。檢測血清抗EB病毒抗體水平,已在臨床上常規(guī)應用于鼻咽癌的血清學診斷。病毒分離為“金標準”,但費時耗力,臨床應用較少。臨床大量使用血清學檢查。近年來,隨著檢驗技術的發(fā)展及對鼻咽癌認識的提高,檢測EB病毒以輔助診斷鼻咽癌的方法越來越多。如免疫熒光和免疫酶法、酶中和分析、免疫印跡、免疫斑點、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)和實時熒光定量PCR技術(Real-time PCR)等。目前鼻咽癌的輔助診斷方法中,ELISA及PCR檢測EB病毒最受重視。ELISA特異性和敏感度均較高；操作簡便；判斷結果客觀；便于原始記錄的保存：并可應用于血液中心的自動化檢測系統(tǒng)。但是只能對血樣進行定性或半定量檢測；早期檢測方面有限制：不能清楚區(qū)分患者處于感染期還是已治愈期；沒有足夠高的靈敏度。PCR方法可尋找病毒基因組以及其表達產(chǎn)物的存在,直接獲得結果,具有靈敏性高：特異性高；定量檢測等優(yōu)點,用于檢測病原微生物感染比免疫學更直接和準確。但對設備、時間和技術依賴性比較高,很難普及。因此研制一種更準確、敏感、快速、簡易的鼻咽癌診斷、篩查方法將是當今該類技術的發(fā)展趨勢。時間分辨熒光免疫測定(Timed-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)利用具有獨特熒光特性的鑭系元素及其螯合物作為標記物標記抗原、抗體、激素、多肽或核酸探針等,待反應體系發(fā)生后,用TRFIA檢測儀測量熒光,據(jù)此判斷反應體系中待測物的濃度值,從而達到定量分析。TRFIA具有區(qū)別于其他標記免疫技術的優(yōu)勢：靈敏度高(10-18mol/孔)；操作簡便；易自動化；標準曲線范圍寬；不受樣品自然熒光干擾；標記物制備簡便且穩(wěn)定；無放射性污染；可用于多標記等優(yōu)點。方法(一)采用間接法研制EB病毒衣殼抗原(VCA)IgA時間分辨免疫熒光分析定量檢測試劑。1.標準品及質(zhì)控品的配制：收集高值陽性的血樣,混合后用IBL ELISA試劑盒測量三次,所得濃度為血樣真實濃度。用樣品稀釋液配制成A:0 AU/mL, B:0.5 AU/mL,C:1 AU/mL,D:2.5 AU/mL,E:10 AU/mL,F:30 AU/mL六個濃度的系列參考標準品和濃度分別為2.5 AU/mL、10 AU/mL、20 AU/mL的質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。2.固相包被抗原的制備：包被液稀釋VCA抗原到2.5μg/mL,100μL孔加入微孔板中,4℃過夜。洗板后每孔加入200μL封閉液,4℃封閉過夜。吸去封閉液后真空抽干,-20℃冷凍保存。3.Eu3+標記抗體的制備及純化：0.5mg抗人IgA抗體洗滌離心6次,按質(zhì)量比5：1加入Eu3+標記試劑室溫震蕩過夜。用分子篩層析柱分離純化,洗脫液洗脫收集,測量吸光度A280,收集高峰管混合,加入10%BSA保護。4.反應系統(tǒng)的優(yōu)化4.1最佳包被濃度：選取1.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL 3μg/mL、3.5μg/mL、4μg/mL8個濃度梯度進行優(yōu)化。4.2 Eu3+標記抗體最佳稀釋比：選取1：400、1：600、1：800、1：1000、1：1500、1：20006個稀釋比梯度進行優(yōu)化。4.3最佳反應時間的確定：選取20+20 min、40+40min、60+60 min、80+80 min、 100+100 min、120+120min 6個反應時間進行優(yōu)化。5.參考值范圍的確定：自制TRFIA試劑測量317份正常人血清,統(tǒng)計頻數(shù)分布后制定ROC曲線,統(tǒng)計分析結果并結合文獻報道情況確定參考值范圍。6.性能指標的評價6.1標準曲線的繪制：由雙對數(shù)數(shù)學模型Log-Log函數(shù)處理。6.2線性范圍及分析靈敏度實驗：平行測定20次A點(零劑量點)的熒光值,計算熒光值的平均值(X)及其標準差(SD),以均值X+2SD的反應量代入上述標準曲線方程,計算分析靈敏度。6.3 HOOK效應：用樣品稀釋液對標準品進行系列稀釋,觀察劑量反應飽和濃度點。6.4準確度實驗：選擇合適濃度的4個常規(guī)檢測樣本1mL,在其中的3份樣本中加入不同濃度相同體積(0.1mL)的待測物標準液制備待回收分析樣本,在另一份樣本中加入同體積的(0.1mL)的樣本稀釋液,制備成基礎樣本。對制備好的3份分析樣本和一份基礎樣本進行3次重復實驗,計算均值和回收率。6.5精密度實驗：三個不同時間各重復測量質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ10次,計算分析間和分析內(nèi)變異系數(shù)(CV)。6.6干擾性實驗：稱取不同質(zhì)量的血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素分別加入到質(zhì)控品Ⅰ、Ⅲ中,使用自制的VCA-IgA檢測試劑進行測定,各設3個復孔,計算各測值均數(shù)。7.臨床考核試驗：以中山生物VCA-IgA ELISA檢測試劑盒為對照試劑,本項目作為分析試劑,對171例臨床樣本進行同步檢測,用SPSS13.0進行數(shù)據(jù)分析。(二)采用間接法研制EB病毒核抗原1(NA1)IgG時間分辨免疫熒光分析定量檢測試劑。1.標準品及質(zhì)控品的配制：收集高值陽性的血樣,混合后用IBL ELISA試劑盒測量三次,所得濃度為血樣真實濃度。用樣品稀釋液配制成A:0 AU/mL,B:2.5 AU/mL,C:10 AU/mL,D:50 AU/mL, E:200 AU/mL, F:500 AU/mL六個濃度的系列參考標準品和濃度分別為20 AU/mL、100AU/mL、400 AU/mL的質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。2.固相包被抗原的制備：包被液稀釋NA1抗原到2.5μg/mL,100μL/孔加入微孔板中,4℃過夜。洗板后每孔加入200μL封閉液4℃封閉過夜。吸去封閉液后真空抽干,-20℃冷凍保存。3.Eu3+標記抗體的制備及純化：0.5mg抗人IgG抗體洗滌離心6次,按質(zhì)量比5：1加入Eu3+標記試劑震蕩過夜。用分子篩層析柱分離純化,洗脫液洗脫收集。測量吸光度A280,收集高峰管混合,加入10%BSA保護。4.反應系統(tǒng)的優(yōu)化4.1最佳包被濃度：選取1.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL 2μ/mL、2.5μg/mL 2μg/mL、3.5μg/mL、4μg/mL8個濃度梯度進行優(yōu)化。4.2 Eu3+標記抗體最佳稀釋比：選取1：100、1：150、1：200、1：300、1：400、1：6008個稀釋比梯度進行優(yōu)化。4.3最佳反應時間的確定：選取20+20 min、40+40min、60+60 min、80+80 min、 100+100 min、120+120min 6個反應時間進行優(yōu)化。5.性能指標的評價5.1標準曲線的繪制：由雙對數(shù)數(shù)學模型Log-Log函數(shù)處理。5.2線性范圍及分析靈敏度實驗：平行測定20次A點(零劑量點)的熒光值,計算熒光值的平均值(X)及其標準差(SD),以均值X+2SD的反應量代入上述標準曲線方程,計算分析靈敏度。5.3 HOOK效應：用樣品稀釋液對標準品進行系列稀釋,觀察劑量反應飽和濃度點。5.4準確度實驗：選擇合適濃度的4個常規(guī)檢測樣本1mL,在其中的3份樣本中加入不同濃度相同體積(0.1mL)的待測物標準液制備待回收分析樣本,在另一份樣本中加入同體積的(0.1mL)的樣本稀釋液,制備成基礎樣本。對制備好的3份分析樣本和一份基礎樣本進行3次重復實驗,計算均值和回收率。5.5精密度實驗：三個不同時間各重復測量質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ10次,計算分析間和分析內(nèi)變異系數(shù)(CV)。5.6干擾性實驗：稱取不同質(zhì)量的血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素分別加入到質(zhì)控品Ⅰ、Ⅲ中,使用自制的NAl-IgG檢測試劑進行測定,各設3個復孔,計算各測值均數(shù)。6.血清盤實驗：用自制TRFIA試劑測量血清盤中7例陰性血清和14例陽性血清。7.臨床考核試驗：以IBL NAl-IgG ELISA檢測試劑盒為對照試劑,本項目作為分析試劑,對148例臨床樣本進行同步檢測,用SPSS13.0進行數(shù)據(jù)分析。結果(一)采用間接法研制EB病毒衣殼抗原(VCA)IgA時間分辨免疫熒光分析定量檢測試劑。本研究所建立的衣殼抗原(VCA) IgA TRFIA間接法的標準品六個點的濃度分別為A:OAU/mL、B:0.5AU/mL、C:1AU/mL、D:2.5AU/mL、E:10AU/mL、 F:30AU/mL;最佳包被濃度、最佳Eu3+標記抗體稀釋比、最佳反應時間分別為2.5μg/mL、1:1000、60+60min;cut off值為2.20AU/mL;分析靈敏度及線性范圍分別為0.029AU/mL和0.029-30 AU/mL；大于100AU/mL出現(xiàn)HOOK效應；回收率在89.44%～97.81%之間；分析間和分析內(nèi)變異系數(shù)(CV)均小于10%；對血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素血無交叉反應；與商業(yè)化ELISA試劑盒在靈敏度和特異性上無統(tǒng)計學差異。(二)采用間接法研制EB病毒核抗原1(NA1)IgG時間分辨免疫熒光分析定量檢測試劑。本研究所建立的核抗原1(NA1)IgG TRFIA間接法的標準品六個點的濃度分別為A:0AU/mL、B:2.5AU/mL、C:10AU/mL.D:50AU/mL.E:200AU/mL、 F:500AU/mL;最佳包被濃度、最佳Eu3+標記抗體稀釋比、最佳反應時間分別為2.5μg/mL?1:200、60+60min;分析靈敏度及線性范圍分別為0.162AU/mL和0.162～500AU/mL;大于1765AU/mL出現(xiàn)HOOK效應；回收率為在106.50%-111.77%之間;分析間和分析內(nèi)變異系數(shù)(CV)均小于10%；對血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素血無交叉反應；血清盤測試與血清盤上陰陽性說明(7例陰性、14例陽性)相符；與商業(yè)化ELISA試劑盒在靈敏度和特異性上無統(tǒng)計學差異。結論上述結果表明本研究研制的EB病毒衣殼抗原(VCA)IgA及核抗原1 (NA1)IgG時間分辨熒光免疫定量檢測試劑的各項指標(靈敏度、準確度、精密度、特異性等)均達到臨床檢測試劑要求,與同類ELISA產(chǎn)品性能相近,有望經(jīng)進一步優(yōu)化后應用于生產(chǎn)。
【關鍵詞】：時間分辨熒光免疫分析(TRFIA) 鼻咽癌(NPC) EB病毒衣殼抗原(VCA)IgA EB病毒核抗原1(NA1)IgG 檢測
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-30
• 第一章 EB病毒衣殼抗原(VCA)-IgA定量檢測時間分辨免疫熒光分析檢測試劑的研制30-49
• 1 實驗材料30-32
• 2 實驗方法32-36
• 3 結果36-46
• 4 討論46-49
• 第二章 EB病毒核抗原1(NA1)-IgG定量檢測時間分辨免疫熒光分析檢測試劑的研制49-65
• 1 實驗材料49-51
• 2 實驗方法51-55
• 3 結果55-61
• 4 討論61-65
• 參考文獻65-70
• 中英文縮略詞70-72
• 碩士期間論文發(fā)表情況72-73
• 致謝73-74

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 姜秀文,魏蓮枝;鼻咽癌的臨床特點和誤診分析[J];重慶醫(yī)學;2005年03期

2 李桂源;劉華英;周鳴;周后德;李小玲;;鼻咽癌癌變的分子機理[J];生物化學與生物物理進展;2006年10期

3 鄧偉;黃天壬;陳萬青;張思維;鄭榮壽;利基林;;中國2003—2007年鼻咽癌發(fā)病與死亡分析[J];腫瘤;2012年03期

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本文編號：1127787