本文關(guān)鍵詞：EB病毒衣殼抗原（VCA）IgA及核抗原1（NA1）IgG時(shí)間分辨熒光免疫定量檢測(cè)試劑的研制

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【摘要】：研究背景及目的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國(guó)南方及東南亞地區(qū)較為常見的惡性腫瘤之一,好發(fā)于廣東、廣西、福建、湖南、香港、臺(tái)灣等及東南亞一些國(guó)家。鼻咽癌多侵犯35～50歲的中老年人群,占總患病人數(shù)的60%,青少年則少見。據(jù)世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)統(tǒng)計(jì),大約80%的鼻咽癌發(fā)生在中國(guó),嚴(yán)重危害人民的健康和生命安全,是中國(guó)重點(diǎn)防治的惡性腫瘤之一。2003～2007年中國(guó)鼻咽癌的發(fā)病率為4.20/10萬(wàn)人,死亡率為2.24/10萬(wàn)人。珠江流域發(fā)病率在10/10萬(wàn)人以上。中國(guó)鼻咽癌年平均死亡率,男性為2.49/10萬(wàn)人,女性為1.27/10萬(wàn)人,南方5省年平均死亡率為4.35/10萬(wàn)人。鼻咽癌的發(fā)生與環(huán)境、遺傳、病毒三者作用相關(guān)。鼻咽癌是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與EB病毒感染有關(guān)的人類癌癥。研究證實(shí)未分化型鼻咽癌與EB病毒感染密切相關(guān)。鼻咽癌早期通常無(wú)明顯癥狀且腫瘤好發(fā)部位比較隱匿,確診往往受到延誤,因而令病人錯(cuò)過(guò)治療的最佳時(shí)機(jī)。研究表明,鼻咽癌首診時(shí)的誤診率高達(dá)86.98%,因而對(duì)鼻咽癌的早期診斷是非常有必要。鼻咽癌5年生存率Ⅰ、Ⅱ期可高達(dá)60%以上,而Ⅲ、Ⅳ鼻咽癌則下降至20%-40%。可見鼻咽癌早期診斷是提高治療效果、爭(zhēng)取良好預(yù)后的關(guān)鍵。近年來(lái)的研究表明,與EB病毒感染相關(guān)的免疫血清學(xué)與生物學(xué)標(biāo)志產(chǎn)物作為鼻咽癌早期篩查、輔助診斷、臨床分期、療效判斷和預(yù)后預(yù)測(cè)有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。EB病毒歸類為皰疹病毒科γ皰疹病毒亞科嗜淋巴病毒屬,可引起兩種不同類型的感染,即增殖性感染和非增值性感染。EB病毒感染與人類多種疾病發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。包括傳染性單核細(xì)胞增多癥和B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、NK細(xì)胞淋巴瘤等免疫細(xì)胞性疾�。槐茄拾�、胃癌等上皮細(xì)胞性疾病。VCA (viral capsid antigen)為病毒衣殼抗原。文獻(xiàn)報(bào)道,血清EB病毒VCA-IgA抗體可以在鼻咽癌發(fā)生前10-61個(gè)月出現(xiàn)。患者的EB病毒抗體在高滴度水平波動(dòng),預(yù)示疾病進(jìn)一步發(fā)展,提示其可能作為鼻咽癌早期診斷和鑒別診斷的標(biāo)志物。在將來(lái)的鼻咽癌篩查計(jì)劃中,將VCA-IgA抗體陽(yáng)性者作為嚴(yán)密監(jiān)測(cè)的人群,進(jìn)行更密切的隨訪和嚴(yán)格的臨床檢查是十分必要的。血清中EB病毒VCA-IgA也可能作為評(píng)價(jià)鼻咽癌療效和監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)的觀測(cè)指標(biāo)。EBNA1 (nuclear antigen 1)見于所有類型的潛伏性感染,是惟一在病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)的蛋白,是病毒成功建立潛伏性感染的必要條件,它與病毒基因復(fù)制和維持病毒顆粒的穩(wěn)定性有關(guān)。EBNA1-IgG于發(fā)病后3-4周出現(xiàn),2-3月后達(dá)到高峰,然后滴度稍稍降低至較高水平并持續(xù)終生,是既往感染的標(biāo)記。有研究表明,在鼻咽癌病人中抗EBNA1抗體可升高10倍。在鼻咽癌的發(fā)展中,抗EB病毒血清標(biāo)志物主要起到短期風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)作用,通過(guò)普查檢測(cè)VCA-IgA及NA1-IgG抗體水平,可提高鼻咽癌篩查的早診率,降低死亡率。檢測(cè)血清抗EB病毒抗體水平,已在臨床上常規(guī)應(yīng)用于鼻咽癌的血清學(xué)診斷。病毒分離為“金標(biāo)準(zhǔn)”,但費(fèi)時(shí)耗力,臨床應(yīng)用較少。臨床大量使用血清學(xué)檢查。近年來(lái),隨著檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展及對(duì)鼻咽癌認(rèn)識(shí)的提高,檢測(cè)EB病毒以輔助診斷鼻咽癌的方法越來(lái)越多。如免疫熒光和免疫酶法、酶中和分析、免疫印跡、免疫斑點(diǎn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time PCR)等。目前鼻咽癌的輔助診斷方法中,ELISA及PCR檢測(cè)EB病毒最受重視。ELISA特異性和敏感度均較高；操作簡(jiǎn)便；判斷結(jié)果客觀；便于原始記錄的保存：并可應(yīng)用于血液中心的自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)。但是只能對(duì)血樣進(jìn)行定性或半定量檢測(cè)；早期檢測(cè)方面有限制：不能清楚區(qū)分患者處于感染期還是已治愈期；沒有足夠高的靈敏度。PCR方法可尋找病毒基因組以及其表達(dá)產(chǎn)物的存在,直接獲得結(jié)果,具有靈敏性高：特異性高；定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),用于檢測(cè)病原微生物感染比免疫學(xué)更直接和準(zhǔn)確。但對(duì)設(shè)備、時(shí)間和技術(shù)依賴性比較高,很難普及。因此研制一種更準(zhǔn)確、敏感、快速、簡(jiǎn)易的鼻咽癌診斷、篩查方法將是當(dāng)今該類技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定(Timed-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)利用具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合物作為標(biāo)記物標(biāo)記抗原、抗體、激素、多肽或核酸探針等,待反應(yīng)體系發(fā)生后,用TRFIA檢測(cè)儀測(cè)量熒光,據(jù)此判斷反應(yīng)體系中待測(cè)物的濃度值,從而達(dá)到定量分析。TRFIA具有區(qū)別于其他標(biāo)記免疫技術(shù)的優(yōu)勢(shì)：靈敏度高(10-18mol/孔)；操作簡(jiǎn)便；易自動(dòng)化；標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬；不受樣品自然熒光干擾；標(biāo)記物制備簡(jiǎn)便且穩(wěn)定；無(wú)放射性污染；可用于多標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。方法(一)采用間接法研制EB病毒衣殼抗原(VCA)IgA時(shí)間分辨免疫熒光分析定量檢測(cè)試劑。1.標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品的配制：收集高值陽(yáng)性的血樣,混合后用IBL ELISA試劑盒測(cè)量三次,所得濃度為血樣真實(shí)濃度。用樣品稀釋液配制成A:0 AU/mL, B:0.5 AU/mL,C:1 AU/mL,D:2.5 AU/mL,E:10 AU/mL,F:30 AU/mL六個(gè)濃度的系列參考標(biāo)準(zhǔn)品和濃度分別為2.5 AU/mL、10 AU/mL、20 AU/mL的質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。2.固相包被抗原的制備：包被液稀釋VCA抗原到2.5μg/mL,100μL孔加入微孔板中,4℃過(guò)夜。洗板后每孔加入200μL封閉液,4℃封閉過(guò)夜。吸去封閉液后真空抽干,-20℃冷凍保存。3.Eu3+標(biāo)記抗體的制備及純化：0.5mg抗人IgA抗體洗滌離心6次,按質(zhì)量比5：1加入Eu3+標(biāo)記試劑室溫震蕩過(guò)夜。用分子篩層析柱分離純化,洗脫液洗脫收集,測(cè)量吸光度A280,收集高峰管混合,加入10%BSA保護(hù)。4.反應(yīng)系統(tǒng)的優(yōu)化4.1最佳包被濃度：選取1.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL 3μg/mL、3.5μg/mL、4μg/mL8個(gè)濃度梯度進(jìn)行優(yōu)化。4.2 Eu3+標(biāo)記抗體最佳稀釋比：選取1：400、1：600、1：800、1：1000、1：1500、1：20006個(gè)稀釋比梯度進(jìn)行優(yōu)化。4.3最佳反應(yīng)時(shí)間的確定：選取20+20 min、40+40min、60+60 min、80+80 min、 100+100 min、120+120min 6個(gè)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。5.參考值范圍的確定：自制TRFIA試劑測(cè)量317份正常人血清,統(tǒng)計(jì)頻數(shù)分布后制定ROC曲線,統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道情況確定參考值范圍。6.性能指標(biāo)的評(píng)價(jià)6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：由雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理。6.2線性范圍及分析靈敏度實(shí)驗(yàn)：平行測(cè)定20次A點(diǎn)(零劑量點(diǎn))的熒光值,計(jì)算熒光值的平均值(X)及其標(biāo)準(zhǔn)差(SD),以均值X+2SD的反應(yīng)量代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算分析靈敏度。6.3 HOOK效應(yīng)：用樣品稀釋液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列稀釋,觀察劑量反應(yīng)飽和濃度點(diǎn)。6.4準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)：選擇合適濃度的4個(gè)常規(guī)檢測(cè)樣本1mL,在其中的3份樣本中加入不同濃度相同體積(0.1mL)的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)液制備待回收分析樣本,在另一份樣本中加入同體積的(0.1mL)的樣本稀釋液,制備成基礎(chǔ)樣本。對(duì)制備好的3份分析樣本和一份基礎(chǔ)樣本進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),計(jì)算均值和回收率。6.5精密度實(shí)驗(yàn)：三個(gè)不同時(shí)間各重復(fù)測(cè)量質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ10次,計(jì)算分析間和分析內(nèi)變異系數(shù)(CV)。6.6干擾性實(shí)驗(yàn)：稱取不同質(zhì)量的血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素分別加入到質(zhì)控品Ⅰ、Ⅲ中,使用自制的VCA-IgA檢測(cè)試劑進(jìn)行測(cè)定,各設(shè)3個(gè)復(fù)孔,計(jì)算各測(cè)值均數(shù)。7.臨床考核試驗(yàn)：以中山生物VCA-IgA ELISA檢測(cè)試劑盒為對(duì)照試劑,本項(xiàng)目作為分析試劑,對(duì)171例臨床樣本進(jìn)行同步檢測(cè),用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。(二)采用間接法研制EB病毒核抗原1(NA1)IgG時(shí)間分辨免疫熒光分析定量檢測(cè)試劑。1.標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品的配制：收集高值陽(yáng)性的血樣,混合后用IBL ELISA試劑盒測(cè)量三次,所得濃度為血樣真實(shí)濃度。用樣品稀釋液配制成A:0 AU/mL,B:2.5 AU/mL,C:10 AU/mL,D:50 AU/mL, E:200 AU/mL, F:500 AU/mL六個(gè)濃度的系列參考標(biāo)準(zhǔn)品和濃度分別為20 AU/mL、100AU/mL、400 AU/mL的質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。2.固相包被抗原的制備：包被液稀釋NA1抗原到2.5μg/mL,100μL/孔加入微孔板中,4℃過(guò)夜。洗板后每孔加入200μL封閉液4℃封閉過(guò)夜。吸去封閉液后真空抽干,-20℃冷凍保存。3.Eu3+標(biāo)記抗體的制備及純化：0.5mg抗人IgG抗體洗滌離心6次,按質(zhì)量比5：1加入Eu3+標(biāo)記試劑震蕩過(guò)夜。用分子篩層析柱分離純化,洗脫液洗脫收集。測(cè)量吸光度A280,收集高峰管混合,加入10%BSA保護(hù)。4.反應(yīng)系統(tǒng)的優(yōu)化4.1最佳包被濃度：選取1.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL 2μ/mL、2.5μg/mL 2μg/mL、3.5μg/mL、4μg/mL8個(gè)濃度梯度進(jìn)行優(yōu)化。4.2 Eu3+標(biāo)記抗體最佳稀釋比：選取1：100、1：150、1：200、1：300、1：400、1：6008個(gè)稀釋比梯度進(jìn)行優(yōu)化。4.3最佳反應(yīng)時(shí)間的確定：選取20+20 min、40+40min、60+60 min、80+80 min、 100+100 min、120+120min 6個(gè)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。5.性能指標(biāo)的評(píng)價(jià)5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：由雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理。5.2線性范圍及分析靈敏度實(shí)驗(yàn)：平行測(cè)定20次A點(diǎn)(零劑量點(diǎn))的熒光值,計(jì)算熒光值的平均值(X)及其標(biāo)準(zhǔn)差(SD),以均值X+2SD的反應(yīng)量代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算分析靈敏度。5.3 HOOK效應(yīng)：用樣品稀釋液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列稀釋,觀察劑量反應(yīng)飽和濃度點(diǎn)。5.4準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)：選擇合適濃度的4個(gè)常規(guī)檢測(cè)樣本1mL,在其中的3份樣本中加入不同濃度相同體積(0.1mL)的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)液制備待回收分析樣本,在另一份樣本中加入同體積的(0.1mL)的樣本稀釋液,制備成基礎(chǔ)樣本。對(duì)制備好的3份分析樣本和一份基礎(chǔ)樣本進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),計(jì)算均值和回收率。5.5精密度實(shí)驗(yàn)：三個(gè)不同時(shí)間各重復(fù)測(cè)量質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ10次,計(jì)算分析間和分析內(nèi)變異系數(shù)(CV)。5.6干擾性實(shí)驗(yàn)：稱取不同質(zhì)量的血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素分別加入到質(zhì)控品Ⅰ、Ⅲ中,使用自制的NAl-IgG檢測(cè)試劑進(jìn)行測(cè)定,各設(shè)3個(gè)復(fù)孔,計(jì)算各測(cè)值均數(shù)。6.血清盤實(shí)驗(yàn)：用自制TRFIA試劑測(cè)量血清盤中7例陰性血清和14例陽(yáng)性血清。7.臨床考核試驗(yàn)：以IBL NAl-IgG ELISA檢測(cè)試劑盒為對(duì)照試劑,本項(xiàng)目作為分析試劑,對(duì)148例臨床樣本進(jìn)行同步檢測(cè),用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果(一)采用間接法研制EB病毒衣殼抗原(VCA)IgA時(shí)間分辨免疫熒光分析定量檢測(cè)試劑。本研究所建立的衣殼抗原(VCA) IgA TRFIA間接法的標(biāo)準(zhǔn)品六個(gè)點(diǎn)的濃度分別為A:OAU/mL、B:0.5AU/mL、C:1AU/mL、D:2.5AU/mL、E:10AU/mL、 F:30AU/mL;最佳包被濃度、最佳Eu3+標(biāo)記抗體稀釋比、最佳反應(yīng)時(shí)間分別為2.5μg/mL、1:1000、60+60min;cut off值為2.20AU/mL;分析靈敏度及線性范圍分別為0.029AU/mL和0.029-30 AU/mL；大于100AU/mL出現(xiàn)HOOK效應(yīng)；回收率在89.44%～97.81%之間；分析間和分析內(nèi)變異系數(shù)(CV)均小于10%；對(duì)血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素血無(wú)交叉反應(yīng)；與商業(yè)化ELISA試劑盒在靈敏度和特異性上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(二)采用間接法研制EB病毒核抗原1(NA1)IgG時(shí)間分辨免疫熒光分析定量檢測(cè)試劑。本研究所建立的核抗原1(NA1)IgG TRFIA間接法的標(biāo)準(zhǔn)品六個(gè)點(diǎn)的濃度分別為A:0AU/mL、B:2.5AU/mL、C:10AU/mL.D:50AU/mL.E:200AU/mL、 F:500AU/mL;最佳包被濃度、最佳Eu3+標(biāo)記抗體稀釋比、最佳反應(yīng)時(shí)間分別為2.5μg/mL?1:200、60+60min;分析靈敏度及線性范圍分別為0.162AU/mL和0.162～500AU/mL;大于1765AU/mL出現(xiàn)HOOK效應(yīng)；回收率為在106.50%-111.77%之間;分析間和分析內(nèi)變異系數(shù)(CV)均小于10%；對(duì)血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素血無(wú)交叉反應(yīng)；血清盤測(cè)試與血清盤上陰陽(yáng)性說(shuō)明(7例陰性、14例陽(yáng)性)相符；與商業(yè)化ELISA試劑盒在靈敏度和特異性上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論上述結(jié)果表明本研究研制的EB病毒衣殼抗原(VCA)IgA及核抗原1 (NA1)IgG時(shí)間分辨熒光免疫定量檢測(cè)試劑的各項(xiàng)指標(biāo)(靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、特異性等)均達(dá)到臨床檢測(cè)試劑要求,與同類ELISA產(chǎn)品性能相近,有望經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化后應(yīng)用于生產(chǎn)。
【關(guān)鍵詞】：時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA) 鼻咽癌(NPC) EB病毒衣殼抗原(VCA)IgA EB病毒核抗原1(NA1)IgG 檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-30
• 第一章 EB病毒衣殼抗原(VCA)-IgA定量檢測(cè)時(shí)間分辨免疫熒光分析檢測(cè)試劑的研制30-49
• 1 實(shí)驗(yàn)材料30-32
• 2 實(shí)驗(yàn)方法32-36
• 3 結(jié)果36-46
• 4 討論46-49
• 第二章 EB病毒核抗原1(NA1)-IgG定量檢測(cè)時(shí)間分辨免疫熒光分析檢測(cè)試劑的研制49-65
• 1 實(shí)驗(yàn)材料49-51
• 2 實(shí)驗(yàn)方法51-55
• 3 結(jié)果55-61
• 4 討論61-65
• 參考文獻(xiàn)65-70
• 中英文縮略詞70-72
• 碩士期間論文發(fā)表情況72-73
• 致謝73-74

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

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本文編號(hào)：1127787