本文關(guān)鍵詞：RNA干擾MMP-2基因?qū)w外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞增殖及移行作用的研究

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【摘要】：目的:首先在體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞株(human lens epithelial cells,h LECs)SRA01/04,然后利用靶向RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染h LECs,干擾細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2),進(jìn)而觀測體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞的增殖、移行能力的變化。由此說明MMP-2在人晶狀體上皮細(xì)胞中的作用和影響,進(jìn)一步論證RNA干擾技術(shù)對抗人晶狀體上皮細(xì)胞移行、增殖的應(yīng)用可行性,以期更深入的討論RNA干擾MMP-2對于后發(fā)性白內(nèi)障的抑制作用。方法:首先是通過人工設(shè)計、合成一條含有靶向干擾MMP-2基因的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,sh RNA)的質(zhì)粒載體,同時設(shè)計、合成一條不含MMP-2基因的sh RNA的陰性對照質(zhì)粒載體;在體外對人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng);利用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細(xì)胞,分別標(biāo)注為MMP-2沉默組、陰性對照組,同時以等體積的培養(yǎng)液替代轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),標(biāo)記為空白對照組;采用實時熒光定量PCR和Western blot技術(shù)手段分別對細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后的MMP-2m RNA及MMP-2蛋白的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測;采用MTT比色法測定不同時間點,即轉(zhuǎn)染后24h,48h及72h時的人晶狀體上皮細(xì)胞的相對增殖能力;最后以細(xì)胞劃痕實驗方法測量細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h和48h時的人晶狀體上皮細(xì)胞的劃痕寬度,并計算得出細(xì)胞的移行愈合率。結(jié)果:人晶狀體上皮細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染24h后,通過測算,MMP-2沉默組的m RNA相對表達(dá)量為0.202±0.075,空白對照組的表達(dá)量1.041±0.163,兩者相比MMP-2沉默組下降了80.6%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而MMP-2沉默組的MMP-2蛋白相對表達(dá)量為80.856±2.165,與空白對照組的184.419±3.584比較下降了55.1%,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),陰性對照組與空白對照組比較無論m RNA或是MMP-2的表達(dá)上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);MTT比色法的結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染后隨著時間的延長,細(xì)胞的增殖能力增高,但在各時間點MMP-2沉默組與陰性對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),同時這兩組較空白對照組的細(xì)胞增殖能力均有所下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);另外,通過細(xì)胞劃痕實驗表明,細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后MMP-2沉默組、空白對照組、陰性對照組的移行愈合率分別為0.2036±0.0414、0.4126±0.0457以及0.3628±0.0228,轉(zhuǎn)染48h后該三組移行愈合率分別為0.2319±0.0562,0.6761±0.0880,0.7448±0.0921,MMP-2沉默組細(xì)胞移行愈合率明顯低于空白對照組及陰性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而陰性對照組與空白對照組之間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:本實驗利用干擾MMP-2表達(dá)的sh RNA能夠有效降低人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04的MMP-2 m RNA和蛋白表達(dá)量,抑制細(xì)胞的移行能力,但對細(xì)胞增殖能力的影響尚不明確。RNA干擾MMP-2的表達(dá)能夠達(dá)到抑制人晶狀體上皮細(xì)胞移行的作用,這為通過基因手段防治后發(fā)性白內(nèi)障的提供了理論依據(jù)、開拓了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：人晶狀體上皮細(xì)胞 基質(zhì)金屬蛋白酶-2 RNA 干擾
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R776
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本文編號：1061486